主题：【分享】怎样自己制作填充色谱柱，对柱管材料、固定相的选择和处理？

解决方案
填充气相色谱柱通常简称填充柱，主要有气固色谱填充柱和气液色谱填充柱两种类型。气固色谱填充柱采用固体物质作为固定相，包括具有吸附活性的无机吸附剂、高分子多孔微球和表面被化学键合的固体物质。气液色谱填充柱中所用的填料是液体固定相，它是由惰性的固体支持物和其表面上涂渍的高沸点有机物液膜所构成。
①填充柱柱管的选择
用作填充柱柱管的材料通常有不锈钢、铜管、铝管、铜镀镍管、玻璃管、聚四氟乙烯管等。铜管和铝管由于催化活性太强且易变形已经不太常用。柱材料的选择应根据待分析样品性质和试验条件而定。如果待分析的样品易分解或者具有腐蚀性，应考虑采用玻璃管或者聚四氟乙烯管。
玻璃管柱的优点是化学惰性好，制备的色谱柱柱效高，制作时便于观察制作情况及填充物的填充情况。缺点是玻璃易碎，在制作和安装时都必须十分小心，操作很不方便，新手经常发生断裂情况。聚四氟乙烯管的优点是耐腐蚀，缺点是不耐高温、不耐高压。
在填充柱中目前最常采用的材料就是不锈钢管，它的最大优点是不破碎、传热性能好、使用寿命长，能够满足常见样品的分析要求。缺点是内壁较粗糙，有活性，比较难于清洗干净。填充柱的柱管在使用前都应该经过清洗和试漏检查。
②气固色谱固定相的选择和处理
用气相色谱分析永久性气体及气态烃时，常采用固体吸附剂作固定相。在固体吸附剂上，永久性气体及气态烃的吸附热差别较大，故可以得到满意的分离。常用的固体吸附剂有非极性的活性炭、石墨化炭黑、中等极性的氧化铝、强极性的硅胶和特殊作用的分子筛等。但需要注意的是：
a.吸附剂的吸附性能与其制备、活化条件有密切关系。不同来源的同种产品或者同一来源的非同批产品，其吸附性能可能存在较大的差异；
b.一般具有催化活性，不宜在高温和存在活性组分的情况下使用；
c.吸附等温线通常是非线性的，进样量较大时易出现色谱峰形不对称。
    硅胶是一种氢键型的强极性固体吸附剂，其化学组成为SiO₂·nH₂O，有细孔硅胶、粗孔硅胶和多孔硅球等。气相色谱使用较多的是粗孔硅胶，其孔径为80～100nm，比表面积近300m²/g，可用于分析N₂O、SO₂、H₂S、SF₆、CF₂Cl₂以及C₁～C₄烷烃等物质。
硅胶的分离能力主要取决于孔径大小和含水量。应用前通常需要经过处理。方法：对市售的色谱专用硅胶，可在200℃下活化处理2h后使用；如果使用市售的非色谱专用硅胶，则先将硅胶用6mol/L盐酸浸泡2h，然后用水冲洗至无Cl^-。晾干后置于马弗炉内，在200～500℃温度下灼烧活化2h后降温取出，贮存于干燥器中备用。
氧化铝有五种不同的晶型，气相色谱常用的主要是γ型，具有中等极性，主要用于分析 C₁～C₄烃类及其异构体，在低温下也能用于分离氢的同位素。氧化铝具有很好的热稳定性和机械强度，但其活性随含水量有较大的变化。故使用前通常需对其进行活化处理(在 450～1350℃灼烧2h)。为保持使用过程中含水量稳定，可将载气先通过含结晶水的硫酸钠(或硫酸铜) 后再进入色谱柱。经过氢氧化钠处理改性的氧化铝，能在320～380℃柱温下分析C₃₆以下的碳氢化合物，峰形很好。
碳素是一类非极性的固体吸附剂，主要有活性炭、石墨化炭黑和碳分子筛等。活性炭是无定形碳，具有微孔结构，比表面积大(800～1000m²/g)，可用于分析永久性气体和低沸点烃类。若涂少量固定液，可用来分析空气、一氧化碳、甲烷、二氧化碳、乙炔、乙烯等混合物。石墨化炭黑是炭黑在惰性气体保护下经高温（2500～3000℃）煅烧而成的石墨状细晶，特别适用于分离空间和结构异构体，也可用于分析硫化氢、二氧化硫、低级醇类、短链脂肪酸、酚、胶类。上述两种碳素固定相用前都需进行活化处理。方法是先用等体积的苯(或甲苯、二甲苯) 冲洗2～3次，然后在350℃通水蒸气洗涤至无浑浊，最后在180℃活化2h即可使用。
    碳分子筛又称为炭多孔小球，是聚偏二氯乙烯小球经高温热解处理后的残留物，比表面积800～1000m²/g，孔径约1.5～2nm，主要用于稀有气体、空气、二氧化碳、氧化亚氮、C₁～C₃烷类分析。多孔炭黑国内外都有商品出售，如由中国科学院化学研究所研制、天津化学试剂二厂生产的TDX-01和TDX-02，国外产品Car-bon Sieve B等即属于此类。使用前通常在180℃通氮气活化3～4h，降温后存于干燥器内备用。
    分子筛是一类人工合成的硅铝酸盐，其基本化学组成为MO·Al₂O₃·xSiO₂·yN₂O，其中M代表Na⁺、 K⁺、 Li⁺或Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺等金属阳离子。分子筛具有均匀分布的孔穴，其大小取决于M金属离子的半径和其在硅铝构架上的位置。一般认为，分子筛的性能主要取决于孔径的大小和表面特性。当试样分子经过分子筛时，比孔径小的分子可进入孔内，比孔径大的分子则被排除于孔外。气相色谱分析中应用的分子筛通常有4A、5A和13X等三种类型，前面的数字表示分子筛的平均孔径，例如4A指的是该分子筛的平均孔径为0.4nm。A、X表示类型，其化学组成稍有差异。A型中Al₂O₃与SiO₂的比例为1︰2，X型的硅铝比则高一些。
    分子筛的表面积很大，内表面积通常有700～800m²/g，外表面积为1～3m²/g。在气相色谱中主要用于分离H₂、O₂、N₂、CO、CH₄以及低温下分析惰性气体等。
    分子筛极易因吸水而失去活性。因此，用前应在550～600℃或在减压条件下于350℃活化2h，降温后贮存于干燥器内。使用过程中要对载气进行干燥处理，样品中如果存在水分也应设法除去。此外，使用时还应注意，某些物质如氨、甲酸、二氧化碳等会被分子筛不可逆吸附。分子筛是否失效通常可从氮、氧的分离情况来判断。失活后的分子筛可以采用上述方法重新活化使用。
  高分子多孔小球是以苯乙烯（或乙基苯乙烯）与二乙烯苯共聚而成的高分子多孔小球，由于是人工合成的，可控制其孔径的大小及表面性质，扩展了气－固色谱的应用范围。如圆柱型颗粒容易填充均匀，数据重线性好。在无液膜存在时，没有“流失”问题，有利于大幅度程序升温。这类高分子多孔小球特别适用于有机物中痕量水的分析，也可用于多元醇、脂肪酸、腈类和胺类的分析。高分子多孔小球分为极性和非极性两种：a、非极性的是由苯乙烯、二乙烯苯共聚而成；b、极性的是苯乙烯、二乙烯苯共聚物中引入极性基团。
③气液色谱固定相的选择和处理
    气液色谱填充柱中所用的填料是液体固定相。它由惰性的固体支持物（载体，又叫担体）和其表面涂渍的高沸点有机物液膜（固定液）所构成。
a.载体
    载体是一种多孔性化学惰性固体，在气相色谱中用来支撑固定液。对载体有如下几点要求：1).表面积较大；2).具有化学惰性和热稳定性；3).有一定的机械强度，使涂渍和填充过程不引起粉碎；4).有适当的孔隙结构，利于两相间快速传质；5).能制成均匀的球状颗粒，利于气相渗透和填充均匀性好；6).有很好的浸润性，便于固定液的均匀分布。
    完全满足上述要求的载体是困难的，人们在实践中只能找出性能比较优良的载体。
    通常分为硅藻土和非硅藻土两大类，每一类又有几种小类。
（i）硅藻土类型：
    白色的：表面积小、疏松、质脆，但它的表面吸附作用和催化作用较小，能用于高温分析，应用于分析极性组分时易获得对称峰；
    红色的：有较大的表面积和较好的机械强度，但吸附性较大。
    一般常用的担体中，白色硅藻土担体有：101担体、102担体、celite545，红色硅藻土担体有：201担体、 6201担体、C-22保温砖。
    （ii）非硅藻土类型：
    氟担体：表面惰性好，可用来分析强极性和腐蚀性物质，但表面积小，机械强度低，对极性固定液的浸润性差。
    玻璃微球：表面积小，柱负荷量小，柱寿命短，其优点是能在较低的柱温下分析高沸点物质，使某些热稳定性差但选择性好的固定液获得应用。
    多孔性高聚物小球：机械强度高，热稳定性好，吸附性低，耐腐蚀，分离效率高，是一种性能优良的新型色谱固定相。
    碳分子筛：中性，表面积大，强度高，柱寿命长，在微量分析上有优越性。
    b. 载体的处理
    一种理想的载体，其表面应该无吸附性和催化性，在操作条件下不与固定液和样品组分反应。但是实际上载体表面完全没有吸附性能和催化性能是不可能的。实验表明，经过灼烧后制成的硅藻土类载体，其表面既有催化活性，也有吸附活性。当载体表面存在氢键活性作用点时，分析能与硅醇、硅醚形成氢键的物质（例如水、醇、胺等一类化合物）时就会观察到相应组分色谱峰的拖尾；同样，用具有酸性(或碱性) 作用点的载体分离碱性(或酸性) 化合物时也会引起相应色谱峰的拖尾，甚至发生一些醇类、萜类、缩醛类等化合物的催化反应。
    为了取得好的分离效果，特别是在分析极性、酸碱性以及氢键型样品时获得对称的色谱峰，人们常采用下述方法对载体进行预处理：
    （i）酸洗：通常用 6mol/L盐酸浸泡载体，加热处理20～30min，然后用水冲洗至中性，用甲醇淋洗、烘干、过筛。也可以用王水或硝酸进行酸洗处理。载体经酸洗后可除去无机杂质，减小吸附性能，适用于分析酸性物质和脂类。使用中应当注意，经酸洗的载体催化活性较大。例如在高温下会使SE-30的硅氧链断裂，PEG-400裂解。不宜分析碱性化合物和醇类。
    （ii）碱洗：将酸洗载体用 10% NaOH-甲醇溶液浸泡或者回流，再用水冲洗至中性，最后用甲醇淋洗、烘干备用。碱洗载体的表面酸性作用点较低，适合于胺类等碱性化合物的分析。但碱洗载体的表面仍残留有微量游离碱，可能会引起非碱性物质(如脂类) 的分解。
    （iii）硅烷化：硅烷化是消除载体表面活性最有效的办法之一。它可以消除载体表面的硅醇基团，减弱生成氢键作用力，使表面惰化。一般的方法是将载体用5%～8%硅烷化试剂的甲苯溶液浸泡或回流，然后用无水甲醇洗至中性，烘干备用。常用的硅烷化试剂有二甲基二氯硅烷（DMCS）、三甲基氯硅烷（TMCS）、和六甲基二硅氨烷（HMDS）。以DMCS的硅烷化效果最好，HMDS其次，TMCS较差。如果用酸洗的载体进行硅烷化，其效果比未酸洗的更好。硅烷化载体适用于分析水、醇、胺类等易形成氢键而产生拖尾的物质。载体经硅烷化处理后，表面由亲水性变成了疏水性，比表面积也相应缩小2～3倍。因此，一般只能涂渍非极性或弱极性固定液，操作温度也应控制在270℃以下。
    （iv）釉化：目的是堵塞载体表面的微孔，改善表面性质。通常将欲处理的载体置于2.3%的Na₂CO₃-K₂CO₃(1:1)水溶液中浸泡两昼夜，烘干后在870℃灼烧3.5h，再升温到980℃灼烧约40min。经过这样处理后，载体表面产生了一层玻璃状的釉质，从而屏蔽或惰化了载体表面的活性中心，增加了机械强度。釉化载体适于分析醇、酸类极性较强的物质，但分析甲醇、甲酸时有不可逆的化学吸附，分析非极性物质时柱效较低。
    c.载体的选择
如果在柱类型方面已选择了填充柱，那么载体的选择也会影响分离。在常用硅藻土担体中，红色担体（如6201、201）可用于分析烷烃、烯烃和芳烃等非极性化合物以及酯、酮等极性较弱的物质。白色担体（如101）可用于分析醇、胺等极性较强的化合物或碱性物质。釉化红色担体（如301）可用于中等极性物质。硅烷化白色担体可用于强极性氢键型物质的测定。
有机氟担体可用于分析水、醇、酸、胺等短链极性化合物以及氯硅烷、氟化氢、氯化氢等腐蚀性物质。玻璃微球担体可用于分析沸点较高的物质。分离酸性物质，如酚类，要用酸洗处理的担体。分离碱性物质，如乙醇胺，要用碱洗处理的担体。微量分析要用硅烷化的担体。
有些特殊的情况下要用特殊的担体，如氟担体分离异氰酸酯类。但是在普通的常量分析中，对担体可以不必过分讲究，甚至如耐火砖粉粒，玻璃珠砂和海沙也可以使用。
    担体的粒度、颗粒均匀性、密度、表面性质等对柱效均有影响。
    （i）担体粒度：担体粒度小时，涡流扩散项减小，会使柱效提高。液相传质阻力项也减小，对柱效有利。担体粒度一般只能小到140目左右。否则会影响透气性，造成过大压差，并且装柱时也难于填充均匀，对柱效不利。
    （ii）担体均匀性：担体均匀性对大直径的制备柱十分重要，它对柱效影响很大。对分析柱而言对柱效影响相对较小。一般对内径3～4毫米的填充柱，常用40～60 目、60～80目、80～100目的硅藻土担体。对玻璃微珠和氟担体，因其几何形状比较规则，大小比较均一，表面比较光滑，不易破碎，又有较好的透气性，故可小至120～140目。
    （iii）担体密度：担体密度的不同可能会影响保留值。同时，可能由于表面性质的差别，而出现担体效应，对峰形产生影响，影响柱效。
    （iv）担体表面性质：担体表面性质对峰形和保留值均有影响。硅藻土担体最大问题是担体效应，即担体与组分之间产生一定作用力，造成峰的拖尾，改变保留时间，甚至对某些组分产生缩合或分解。最常见是拖尾现象，特别是对易生成氢键的化合物。
d.固定液（参见第35问）

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案例分析
  ①固定液和担体的配制
要制备一根高效能的填充柱，不仅要选择合适的固定液和担体，还要掌握固定液的涂渍方法和色谱柱的填充技术。无机和有机吸附剂类固定相一般不需要涂渍其他固定液就可以直接填充，制作方法比较简单。为了叙述的简便，举例制作一根规格为2m× 3mm的不锈钢填充柱，固定液为SE-30，配比为5%，担体为Chromosorb W-HP 80～100目。根据色谱柱的规格，就可以计算出所需要的担体的量，本例中需要担体约10克。然后根据担体的量计算所需要的固定液的量，本例中需要的固定液的量为：10g× 5% = 0.5g。
根据固定液选择合适的溶剂，溶剂的选择通常遵循三个原则：a.不与固定液起化学反应；b.能和固定液形成无限互溶体系，当加入担体后不会出现分层现象。c.沸点适当，有一定的挥发性。有机溶剂的用量一般为担体体积的2倍左右。本例中选择石油醚为溶剂。
这样我们就确定了需要担体10克，固定液（SE-30）0.5克，溶剂为石油醚。将称取好的固定液溶解在选定的有机溶剂中制成涂渍溶液。为了使固定液完全溶解，可以将溶液置于热水浴上加热，但应该控制温度低于所用溶剂沸点以下20℃。待固定液完全溶解后，缓缓倒入经预处理和筛分过的担体。在适当温度下轻轻摇动容器，让其中溶剂慢慢的自然挥发后即涂渍完毕。
如果希望加快工作进度，也可以使用旋转蒸发器在适当的温度下除去有机溶剂。在涂渍过程中应注意不能猛烈的搅拌，以免损伤担体。如果固定液的溶解性能较差，可以采用如下的办法：将已知量的固定液和溶剂置于圆低烧瓶内，接上冷凝器，然后加热回流0.5h，待固定液完全溶解后缓缓加入担体，继续回流1.5～2.0h。最后担体和溶剂倒入烧杯，置于通风橱内让溶剂自然挥发至干。
②固定相的填充方法：
固定相填充质量的好坏直接影响填充柱的柱效。一根填充较好的色谱柱，通常理论塔板数应该达到2000/米。为了获得最佳的填充效果可以根据情况选择下面不同的方法。
a.抽空法：
需要工具：真空泵、两根橡胶管、橡胶棒、铁架台、滴定夹、烧杯、药勺、小三角漏斗、细金属棍（在柱两端塞玻璃棉用）、缓冲罐。
操作步骤：
i.把空柱竖直固定在铁架台上，两端向上夹紧。
ii.色谱柱有两种，一种是两端一样长的，另一种是两端一长一短的。两端一样长的在填充时不分方向，而两端一长一短的则有方向性，长的一端接进样器，短的一端接检测器，装柱前要将小三角漏斗接在进样口的一端。用10厘米长左右的软橡胶管将柱和漏斗套在一起，注意要套得较紧，以免加入担体时会泄漏。
iii.将玻璃棉塞入空柱连接检测器的一端，深度约5厘米。
iv.把约50厘米长的硅橡胶管一头接在缓冲罐上，另一头接在空柱的检测器一端。
v.在小漏斗里加入少许担体（约1～2mL），用橡胶棒轻轻敲击空柱使担体落入柱管中，开动真空泵，使这少许担体快速到达玻璃棉部位并形成有效阻塞。
vi.继续在漏斗里加入担体，并慢慢敲击柱的不同位置，使担体尽量紧密，基本填满时仔细敲击柱，担体紧缩一点就再加入一点，直至无法再紧密为止。
vii.拨掉进样口端的小漏斗，加入一条玻璃棉，塞紧。
viii.如果是玻璃柱，要在两端各套上一个胶圈，防止螺母落下时打碎色谱柱。
ix.在柱上做标记后（推荐挂金属小牌），装入色谱柱炉膛箱中老化。
b.加压法：
将填充柱的一端塞好硅烷化的玻璃棉，另一端与填料池连接。先将固定相倒入填料池，填料池的另一端出口与氮气的减压阀连接。对于常见的内径为2mm的填充柱，可调节气体流量为30mL/min左右，其他不同内径的填充柱气流可作适当的调节，将填充池中的固定相压入填充柱中，同时用橡胶棒或者木棒轻敲填充柱使固定相填充均匀。固定相填充完毕后，在原来连接填充池的一端塞上硅烷化的玻璃棉，注意这一端应该与色谱仪的进样室连接，另一端作为出口与检测器连接，不能接反。
c.手工填充法：
这种方法一般只用于某些低沸点固定液的填充。通常采用边装边敲打的办法。每次加进柱内的填料不宜太多。
上述三种方法中最常采用的是抽空法，操作相对容易。手工填充法只适合较短的色谱柱，并且柱效一般不高。填充时应该注意两点：一是固定相要填充均匀和紧密适度，柱内不留有死体积或者间隙；二是要避免填充过程中敲打震动过猛，造成固定相机械粉碎。