主题：【分享】校准曲线（二）：最低检出限（LOD）和最低定量限（LLOQ）

作者微信：Lab_Map

上期简单的讨论了单点线性，两点线性和多点线性的选择，主要讨论了是否能够强制线性过原点。这期讨论校准曲线中的另一个问题：最低检出限（LOD）和最低定量限（LLOQ）的选择

开始之前，先看一下信噪比和误差。在实际测试中，我们都遇到过这种情况：如果信号响应值小，信噪比低，那么测量误差就比较大；如果信号响应值大，出峰非常好，信噪比好，那么测量误差就很小，哪么信号比和误差的关系是什么？这个直接关系着 最低检出限（LOD）和最低定量限（LLOD）的选择
1信噪比（S/N）和测量信号误差（RSD%）

如图1所示，噪音（noise）是基线到噪音顶部的距离（0.18units），信号（Signal）是噪音顶部到峰最高点的距离（大约1.14unit），那么信噪比（s/n）大约等于1.14/0.18=6.3，同样，也可以用软件自动算出峰的信噪比

方程1给出了测量信号误差与信噪比的关系，图1中的测量信号误差（%RSD）等于50/6.3=7.3%，
将信噪比和误差的关系做出一条曲线，如下图所示，信噪比越高，测量信号误差越低，当信噪比大于50时，测量信号误差（RSD%）已经低于1%了。

2测量信号误差和总误差

如方程2所示，测试中各个环节都有可能带来误差 ，总误差是E_T是各个环节的误差的集合。E₁可能是样品前处理带来的误差，E₂可能是自动进样器带来的误差，E₃可能是测量信号带来的误差等等。
那么最大的误差源决定了总误差，要想减小总误差，首先要从最大的误差源下手。
一般来说，如果有多个来源的误差，如果其中某个误差源的RSD小于总RSD的一半 ，那么这个误差源的贡献将小于总误差的15%
举个例子，如果某个方法要求其RSD%小于20%，哪么这个样品的信噪比（S/N）最低该是多少？通过方程1可以得出：

所以这个方法s/n最低是50/10=5
3最低检出限（LOD）
什么是最低检出限（LOD），简单而言就是仪器能够检测到的最低信号，ICH（The International Committee on Harmonization ）给出了三种计算LOD的方法：

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  视觉评估
  就是肉眼能够看到的最低信号，这钟方法主观性太强，不推荐使用，不过可以用来确定是否接近最低检出限
  
  
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  信噪比
  能够满足信噪比s/n等于3的为最低检出限，我们可以通过计算其信噪比来看是否满足最低检出限的要求，但有一个更好的办法就是将信噪比转化为误差%RSD,如公式一所示，最低检出限的%RSD约等于50/3=17%，选择某个浓度，只要连续进样6针或7针，计算其%RSD，就可确定是否满足最低检出限的要求
  
  
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  通过标准偏差和斜率来计算LOD，如方程4所示： σ是标准偏差，S是斜率
  
  还记得上期举个哪个例子吗？如下图，标准偏差σ等于0.5244，
  s是0.9963，那么LOD=3.3*0.5244/0.9963=1.74ng/ml,
  
  

那么可以连续进样6针或7针浓度为1.74ng/ml的样品，计算其%RSD是否满足17%


4最低定量限（LLOQ）
最低定量限就是能够准确定量的最低浓度是多少，这个直接决定了线性的最低浓度是多少
ICH（The International Committee on Harmonization ）给出了三种计算LLOQ的方法，与计算LOD的方法一样

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  视觉评估
  这种方法不知道具体该如何操作，在此直接忽略掉
  
  
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  信噪比
  最低定量限的要满足的信噪比是10:1，那么转为为误差%RSD是5
  
  
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  通过标准偏差和斜率来计算LLOQ，如方程4所示： σ是标准偏差，S是斜率
  
  
  

那么上图例子的LLOQ等于10*0.5244/0.9963=5.26ng/ml
最低检出限LOD要求的信噪比为3:1.转化为%RSD为17%，最低定量限LLOQ要求的信噪比是10:1，转化为%RSD为5。LOD和LLOQ的设定在方法开发时是非常重要的，如果设定的不合理，就会带来很大的误差，同样也决定了线性能够设定的最低浓度是多少。