主题：【第九届原创】液相色谱分析中常见基线问题及案例解析

液相色谱分析中常见基线问题及案例解析

1 前言
        色谱分析中基线噪音大、规律性波动和漂移是比较常见的基线问题，这些异常的基线对方法的检测灵敏度和杂质组分的检出能力具有很大影响，特别是在样品纯度测试以及痕量残留物质检测中，异常的基线将会影响杂质组分和痕量残留物质的定性和定量。液相色谱中影响基线的因素很多，既会受到仪器硬件，如泵、混合器、灯能量和检测器等影响，也会受到外界因素，如温度、流动相组成和使用添加剂等因素的影响。论坛中关于基线问题的帖子很多，许多老师对基线问题产生的原因及解决方法进行了非常详细的总结。本贴以Waters e2695和VARIAN $$lc240为例，例举了一些在实验过程中遇到的基线问题以及相应的解决方法，整理出来与各位老师一起分享。
2 案例解析
2.1 单向阀对压力波动和基线的影响
        之前采用Waters e2695和2414示差检测器测定蜂蜜中糖含量（http://bbs.instrument.com.cn/topic/6270474）的过程中偶尔会出现基线波动异常的情况，并且伴随着泵节奏发生改变，检查发现仪器压力波动异常。依据以往经验首先怀疑是流动相中有气泡，于是停泵、对流动相进行超声脱气，然而重新开泵时发现仪器压力一直很小并且不断波动，运行一段时间后，泵自动停止运转并发出警报“lost prime”。Purge管路中的气泡，dry prime模式下用针筒抽取管路中的流动相，此时发现没有流动相流出，于是意识到问题所在。由于采用的是流动相在线混合的方式，其中一个通道走的是纯乙腈，该仪器在用到纯乙腈或高比例乙腈时单向阀经常会出现问题，据说该故障是由于乙腈发生交联黏住单向阀中的宝石球引起的。于是根据经验，对单向阀进行拆卸并超声清洗。

        拆卸单向阀时，由于重力作用流动相会不断流出（平时使用时流动相放于仪器的上端），要阻止流动相的流动有两种方法，（1）直接将管路从流动相瓶中拿出来，但是也会有少量残余的液体流出；（2）关闭GPV（梯度比例阀）。第一种方法简单粗暴，不用多介绍，着重讲一下GPV的关闭方法，见下图。

      关闭GPV之后就可以拆卸单向阀了，Waters e2695有两个单向阀，任何一个单向阀有问题都会引起压力波动，因此最好两个同时进行清洗。单向阀清洗流程：先将单向阀用5％左右硝酸溶液超声15~30min，然后换用纯水超声15~30min，最后换用甲醇超声15~30min，如果时间充裕，多超声一会也无妨。

      清洗、安装好单向阀（安装时两个单向阀的箭头均朝上）后再次在dry prime模式下用针筒抽取管路中的流动相，排除气泡。排气结束后重新启动泵，仪器压力逐渐变大，系统压力波动恢复到允许的范围内，走基线和测定时基线波动有所改善。
2.2 参数设置对基线的影响
      有些仪器能够通过修改灵敏度或者增益等参数影响色谱图的基线和信号响应。Waters 2414示差检测器就有这样的功能，其灵敏度有1~1024共11种选项，同样以蜂蜜中糖含量测定为例，选择低、中、高3种模式进行测定，考察灵敏度对基线噪音的影响。

        对比不同灵敏度模式下测定的色谱图、基线噪音和压力波动可以发现，灵敏度对色谱峰的响应值和基线噪音有很大的影响，灵敏度越大，色谱峰响应值越高，同时基线噪音也越大。当灵敏度由4变为128时，果糖的响应值也由60MV增加到2000MV，同时基线噪音由2MV左右增加到50MV左右。从压力波动的图中可以发现，灵敏度的改变对压力波动几乎没有影响，不同灵敏度模式下压力波动范围均维持在20psi左右，可见压力并不是此次噪音增大的主要因素。


2.3 流动相混合方式对基线的影响
        通常液相色谱仪配置高压二元泵或者低压四元泵，而泵的冲程体积以及混合器（二元高压泵）的体积大小均会对色谱基线噪音产生影响，泵的冲程体积越小以及混合器的体积越大，由输液造成的脉冲相对越小，基线越平稳。示差检测器是连续检测样品池和参比池间液体折光指数差值的检测器，该检测器对流动相的变化和温度都很敏感，流动相通过比例阀进行在线混合可能导致流动相混合不均匀引起液体折光率产生微弱差异，同时乙腈与水的在线混合也可能引起温度的变化。采用单泵预混的方式可以避免上述问题，因此使用示差检测器时，如果流动相需要用混合溶剂，建议先将流动相进行预混，并采用单一流路的方式运行。实践证明，采用流动相预混和单一流路的方式基本消除了测糖过程中的基线波动现象。

2.4 氘灯对基线的影响
      氘灯是紫外检测器中非常重要的光学部件，在生产初期就被厂家赋予了一定的生命值，其设计使用时间有500、1000，2000小时等等。当氘灯使用时间超过设计使用时间后就可能出现氘灯能量下降、基线漂移和噪音增大等现象。因此如果实验中出现基线漂移和噪音增大的情况，有必要去检查一下氘灯的使用时间和氘灯能量，例如下面的这个案例。

        上图中1是更换氘灯前4种物质的混合标准溶液色谱图，该色谱图中4种物质的峰型、响应值、分离度等都还好，但是通过放大图可以发现，基线噪音还是很明显的，其基线噪音大约为4×10^-4AU(检定规程要求≤5×10^-4AU)，虽然能满足检定规程的要求，但是考虑灯的使用时间已经很长，决定还是检查一下灯能量。

        通过检查发现，该仪器的氘灯已经使用了5038小时（设计使用时间为2000小时，8000为自行修改的数值），氘灯能量约为28000，不仅使用时间大大超过设计使用时间，而且氘灯能量也明显下降，于是决定对氘灯进行更换。《2998检测器操作指南》上有详细的换灯步骤，不多介绍。


        上图是拆卸下来的旧氘灯与新氘灯的对比图，从图中可以看到旧氘灯的灯丝附近已经产生非常明显的“黑眼圈”，显然是“用眼过度”了。更换完氘灯，在软件中设置氘灯序列号、安装日期等信息，检查、记录新氘灯的氘灯能量值，已备日后查验。具体步骤见下图：

      新的氘灯能量约为60000，原先旧氘灯的能量已经下降了一半。安装好新氘灯后重新对标准溶液进行测试，测试结果如下图：

        通过基线放大图可以发现，更换氘灯后基线噪音有所改善，其基线噪音大约为5×10^-5AU。
2.5 流通池污染对基线的影响
    同样是上面4种物质的混合标准溶液，进样之前，在平衡色谱柱的时候发现基线漂的很厉害，进样后基线波动很大，而且在第4种物质出峰处基线往上漂移，严重该物质的影响定性和定量。

        通过一系列的排查，排除掉单向阀、色谱柱、流动相和氘灯等因素，最后检查流通池。由于实验室有两台相同型号的检测器，在确保另外一台设备完好的情况下将流通池进行调换，调换后发现，原先有故障的设备恢复了正常，相反，原来正常的设备基线噪音变大，从而表明流通池出了问题。对流通池进行清洗，清洗之后基线恢复了正常（操作指南上有流通池的清洗步骤）。
2.6 流动相对基线的影响
      高效液相色谱仪在测定之前通常需要对流动相进行切换，尤其用到缓冲盐时需要用高比例的水相先进行过渡，然后再用流动相平衡色谱柱，如果测定时操之过急，色谱柱未完全平衡就进行测定容易出现基线不同程度的漂移。下图是有机酸测定时色谱柱平衡的基线图，由于流动相用到了磷酸二氢钠（磷酸调pH值3.0），而且在较低的波长下进行测定（218nm），因此在色谱柱平衡阶段出现了基线向下漂移的情况，经过一段时间的平衡，基线下降趋势减缓并逐渐走平。

      流动相对基线噪音的影响因素很多，例如气泡、污染物、添加剂、缓冲盐等，都可能导致基线噪音增大或者基线的漂移。
2.7 反压（又叫背压）对基线的影响
        高效液相色谱仪的系统压力较高，色谱柱是产生系统压力的主要部件，流动相流过色谱柱和检测器之后压力迅速下降会使流通池中产生气泡，从而影响基线。反压抑制器能够减缓流动相流出流通池时的压力下降程度，防止流通池中产生气泡。有些仪器是在检测器后面加上一段比较细的管路，还有些仪器是在检测器后面加上一个反压抑制器，通过较细的管路或者反压抑制器对检测器形成一定的反压。不合适的反压也会对仪器或者基线产生一定的影响，反压太高超过流通池的耐受压力，会导致流通池的损坏；反压不够流通池中容易产生气泡，影响基线，例如下面这个案例。
        下图是VARIAN $$lc 240液相色谱仪平衡色谱柱时的基线图，从图中可以看出，每隔10min左右基线就会产生一个波动信号，而且非常有规律，排查原因发现，原来是将伸入废液瓶的反压抑制器弄掉了，重新安装后基线恢复正常。

3 小结
        本文从实际案例出发，介绍了液相色谱分析中常见的几种基线问题及相应的解决方法，然而影响液相色谱基线问题的原因还有很多，除了上述提到的因素外，温度、检测波长、漏液、色谱柱、电压等原因也可能引起基线有异常，如果在日常分析中遇到基线问题，可以先对上述几种原因进行逐一排查。另外，希望本帖是抛砖引玉之贴，各位老师可以将平时分析过程中遇到的一些异常情况及解决过程记录下来，一起分享，今天您解决的问题或许就会成为我明天的困惑。