主题：【第十七届原创】有别于苯酚硫酸法的食用菌多糖检测方法

有别于苯酚硫酸法的食用菌多糖检测方法

K-YBGL套装

向1号瓶中添加9mL 200 mM乙酸钠缓冲液（pH4.5）（即，将1号瓶内容物稀释至11 mL）。得到溶液1。

将溶液分成体积适当的多份等分溶液，并储存于聚丙烯管中。不使用时置于-10°℃以下保存，可稳定2年以上。使用时将其置于冰上的将了以上。仅在需要时稀释第二瓶内容物。

1号瓶：（x2）外切-1，3-β-葡聚糖酶与β-葡萄糖苷酶硫酸铵悬浮液，2.0mL。置于4℃保存。有效期限请查看试剂瓶标签。

3号瓶：GOPOD 试剂缓冲液。缓冲液（50 mL，pH 7.4）。对羟基苯甲酸和叠氮化钠（0.09%）。

置于4°℃ 保存。有效期限请查看试剂瓶标签。

用蒸馏水将 GOPOD 试剂缓冲液稀释定容至 1 L。得到溶液2。现配现用。

注意：

1，浓缩缓冲液在储存期间可能会形成盐晶体。在使用蒸馏水将该缓冲液稀释至1L 时，这些晶体必须完全溶解。

2.缓冲液中含0.09%（w/v）叠氮化钠。叠氮化钠是一种有毒的化学物质，应按照相应要求小心处理。

用约20mL溶液2溶解4号瓶内容物（GOPOD酶试剂），并将得到的溶液定量转移至装有剩

余溶液2的瓶中。

用铝箔包裹容器，以避免瓶内试剂受到光的照射。得到的试剂为葡萄糖测定试剂（GOPOD试剂）。在4 ℃下可稳定1个月，在-10°℃以下可稳定 12个月。

如果GOPOD试剂需要冷冻保存，最好是将试剂分为多份等分溶液再进行保存。避免反复冻融。新配制的溶液可能呈淡黄色或淡粉红色。置于4℃保存时可能呈深粉红色。以蒸馏水为对照，该溶液的吸光度值应小于0.05

测定酵母和蘑菇制剂中的1，3：1，6-β-葡聚糖含量：

A.测定总葡聚糖含量（a-葡聚糖+β-葡聚糖）

a.总葡聚糖的溶解和部分水解

1，将蘑菇或酵母样品置于离心磨碎机中磨碎，直至全部通过孔径为1.0 mm的筛网。

2.将磨碎的样品（约 90 mg，准确称取）添加至一个 20×125 mm 的 Fisher 品牌培养管中。轻轻敲击试管壁，确保所有样品落至管底。





向每个试管中添加 2.0 mL 冰冷的 12 M 硫酸，盖上管盖，将试管置于旋涡混合器上剧烈搅拌。将试管置于冰水浴中孵育2小时。定期将试管置于旋涡混合器上剧烈搅拌（多次搅拌，每次10至15秒）（确保β-葡聚糖完全溶解）。

冰水浴中孵育2小时后再次旋涡混匀一次

向每个试管中添加4mL水，盖上管盖，将试管置于旋涡混合器上剧烈搅拌10秒。然后添加6mL水，盖上管盖，再次搅拌10秒。



松开管盖，将试管置于沸水浴（约100℃）中。5分钟后，拧紧管盖，继续孵育 2 小时。



将试管冷却至室温，然后小心拧开管盖。

使用一个装有200 mM乙酸钠缓冲液（pH4.5）的水洗瓶，将试管内容物转移至一个100 mL的容量瓶中。每个试管重复相同操作。

向容量瓶中添加6 mL8.0 M氢氧化钠溶液，用200 mM乙酸钠缓冲液（pH 4.5）

定容至刻度线。

颠倒试管，均匀混合内容物，并量取等分溶液，转移至微量离心管中。

将等分溶液在13000 rpm下离心5分钟。





量取 0.1 mL 过滤或离心萃取液的等分溶液（一式两份），并将其转移至玻璃试管（16*100 mm）底部。

向每个试管中添加 0.1 mL溶液1外切-1，3-B-葡聚糖酶与β-葡萄糖苷酶

将试管置于旋涡混合器上混合均匀，然后置于 40 ℃ 下孵育 60 分钟。

试剂空白样：0.2 mL 乙酸钠缓冲液（200 mM，pH 4.5）+ 3.0 mL GOPOD试剂。

D-葡萄糖标准品：0.1 mL5号瓶内容物（D-葡萄糖标准品，1 mg/mL）+0.1mL乙酸钠缓冲液（200 mM，pH4.5）+3.0 mL GOPOD 试剂。

向每个试管中添加3.0 mL GOPOD试剂，然后置于40℃下孵育20分钟。

对照试剂空白样，测定所有溶液在 510 nm 波长下的吸光度值。

B.测定 a-葡聚糖

a-葡聚糖的溶解、水解和测定

将磨碎的样品（约100 mg，准确称取）添加至一个20×125 mm的Fisher品牌培养管中。轻轻敲击试管壁，确保所有样品落至管底。

在每个试管中放入一个磁力搅拌子（5×15 mm），

然后加入2mL1.7M 氢氧化钠溶液。将试管置于冰浴/水浴槽中，并置于磁力搅拌器上搅拌近20分钟，使颗粒悬浮。

向每个试管中添加8mL 1.2 M乙酸钠缓冲液（pH3.8），边加入边搅拌。

立即添加0.2 mL 2号瓶内容物[淀粉葡糖苷酶与蔗糖酶]和0.05 mL7号瓶内容物[海藻糖酶]，混合均匀，然后将试管置于40℃的水浴槽中。

将试管置于40℃下孵育60分钟，期间置于旋涡混合器上间歇搅拌。

对于a-葡聚糖含量高于10%的样品：（使用一个水洗瓶）将试管内容物定量转移至一个100mL的容量瓶中，然后用水定容至刻度线。混合均匀。将等分溶液在13000 rpm下离心10分钟，或者用Whatman 1号滤纸（9 cm）过滤溶液。

对于a-葡聚糖含量低于10%的样品：将2mL溶液转移至微量离心管中，在13000 rpm下离心5分钟。对于这类样品，试管内的最终体积约为10.35 mL（然而，不同分析样品的最终体积可能略有差异）。在有些情况下，计算时应适当考虑溶液体积的差异。

将稀释或未稀释的上清液的0.1 mL等分溶液（一式两份）转移至玻璃试管16×100mm

添加0.1 mL乙酸钠缓冲液（200 mM，pH4.5）和3.0 mL GOPOD试剂，然后将试管置于40℃下孵育20分钟。