主题：【分享】高效液相色谱技能篇|关于加校正因子对照法的小知识（中国药典）

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发表于：2024/09/08 21:03:51 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

加校正因子对照法是一种在高效液相色谱（HPLC）分析中用于测定杂质含量的方法。在这种方法中，由于不同物质在色谱系统中的响应因子可能不同，为了准确测定杂质的含量，需要引入校正因子来校准这种差异。

01.什么是校正因子？

校正因子是指单位质量参比物质（包括内标）的色谱响应与单位质量待测物的色谱响应的比值，即用参比物质的色谱响应校正待测物质的色谱响应。需作校正计算的杂质，通常以主成分为参比，也可以供试品中存在的已知杂质或加入的另一成分为参比。

02.如何计算校正因子？

1）单点计算

在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取待测物对照品和参比物质对照品各适量，配制待测杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按下式计算待测杂质的校正因子。

式中，C_A为待测物的浓度；A_A为待测物的色谱响应（峰面积或峰高）；C_B为参比物质的浓度；A_B为参比物质的色谱响应（峰面积或峰高）。

2）标准曲线法计算

也可精密称（量）取主成分参比物质对照品和杂质对照品各适量，分别配制成不同浓度的溶液，分别精密量取各适量，进样，记录色谱图，绘制主成分参比物质浓度和杂质浓度对其峰面积的回归曲线，以主成分参比物质回归直线斜率与杂质回归直线斜率的比计算校正因子。

校正因子=主成分斜率/杂质斜率，即校正因子=10000/15000=0.67

03.关于中国药典对杂质定量的计算以主成分作为参比物质测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液。1）作为对照溶液（或取主成分对照品配制成与杂质限度相当的溶液，作为对照品溶液），精密量取适量，进样，记录色谱图。对照溶液的RSD要求：a.除另有规定外，通常含量低于 0.5%的杂质，峰面积测量值的相对标准偏差（RSD）应小于10%；b.含量在 0.5%～2%的杂质，峰面积测量值的 RSD 应小于 5%；c.含量大于 2%的杂质，峰面积测量值的RSD 应小于 2%。2）再精密量取供试品溶液适量，进样。3）除另有规定外，供试品溶液的色谱图记录时间，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照（或对照品）溶液主成分的峰面积比较，计算各杂质含量。

C_A=A_A/A_B×校正因子×C_B

式中，C_A为杂质的浓度；

A_A为杂质的色谱响应（峰面积）；

C_B为对照品的浓度；

A_B为对照品的色谱响应（峰面积）。

04.关于杂质定量中校正因子的应用

参考《化学药物杂质研究的技术指导原则》，一般情况下，校正因子在0.9～1.1时可不予校正，直接采用不加校正因子的自身对照法定量；超出该范围，如采用主成分对照法的定量方式，须用校正因子进行校正，即“加校正因子的对照法”以保证杂质定量的准确性。

关于早期CDE老师在《HPLC法校正因子研究中的几个问题》一文中表明：如校正因子在0.2～5.0范围以外时，表明杂质与主成分的UV吸收相差过大，校正因子的作用会受到显著影响，此时应改变检测波长等检测条件，使校正因子位于上述范围内，或使用结构或UV吸收与该杂质接近的另一标准物质为参照物质（如对照品易于获得、标准已采用对照品外标法定量的另一特定杂质），重新确立校正因子；如校正因子仍无法调节至适当范围，需考虑采用杂质对照品外标法等适当的杂质方式定量。

05.与不加校正因子对照法得区别是？

答：加校正因子对照法与不加校正因子对照法的主要区别在于是否考虑了杂质与主成分之间的响应差异：

1）加校正因子对照法：

a.在这种方法中，由于杂质与主成分在色谱系统中的响应可能不同，因此引入校正因子来调整这种差异，以确保杂质定量的准确性。

b.通常在杂质的响应因子与主成分的响应因子比值不在0.9～1.1的范围内时使用。

c.需要先通过实验测定杂质和主成分的响应值，然后计算出校正因子。

2）不加校正因子对照法：

a.这种方法假设杂质与主成分在色谱系统中的响应相当接近，或者响应差异对定量结果的影响可以忽略不计。

b.当杂质的响应因子与主成分的响应因子比值在0.9～1.1的范围内时，可以直接使用这种方法，不需要额外的校正。

c.计算时直接比较供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积与对照溶液主成分的峰面积，不涉及校正因子。

06.如果我获取不到杂质的标准品，如何做校正因子的确认？

答：1）使用主成分作为参照：

通过HPLC分析，得到主成分和杂质的色谱峰面积；计算校正因子，即主成分的峰面积与杂质峰面积的比值。

2）利用文献数据：

查阅相关文献，找到已报道的类似杂质的校正因子；如果找到的数据可靠，可以借鉴这些数据作为校正因子。

3）调整色谱条件：

可以尝试改变检测波长或提高样品的进样浓度，以使杂质的响应因子增大，与主药的响应因子接近。如果杂质的响应因子和主药的响应因子都较大，且在当前样品浓度下都能成线性，则这种方法较为理想。如果响应因子较小，则考虑提高样品浓度，使杂质在更大的浓度范围内成线性?。 总结一下：校正因子是高效液相色谱（HPLC）分析中用于校准不同物质响应差异的关键参数，它通过比较待测物质与参比物质（通常是主成分）的色谱响应来计算。在确定校正因子时，需精确配制对照品溶液并进行色谱分析，以确保准确测定杂质含量。中国药典建议，当校正因子介于0.9至1.1时，可不进行校正；超出此范围则需使用校正因子进行定量。若校正因子超出0.2至5.0的范围，可能需要调整检测条件或采用其他定量方法。这种方法提高了HPLC分析中杂质定量的准确性和可靠性。