主题：【分享】高效液相色谱方法开发篇|关于SEC的方法开发小知识

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发表于：2024/10/15 12:49:31 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

今天主要讲讲SEC方法开发过程中的一般考量，SEC的方法开发相比于RP会略微的简单一些，并不会很复杂。

01.SEC方法开发的一般步骤

1）确定溶剂、温度和相化学组合：在购买色谱柱之前，参考聚合物-溶剂参考表（Polymer-To-Solvent Reference Table）来确定适用于您应用的相和溶剂。（参考链接：https://www.agilent.com.cn/cs/library/

technicaloverviews/public/5991-6802CHCN.pdf）

2）确定样品的分子量范围：根据先验知识或产品相关知识，估算样品的分子量范围；也可以用技术手段鉴定样品的分子量。
3）对样品进行预处理：根据样品性质选择合适的溶剂进行溶解；去除样品中的杂质或干扰物，如蛋白质沉淀、离心或过滤；如果需要，进行样品浓缩或稀释，以适应色谱系统的要求。
4）选择色谱模式：SEC模式；流动相的组成通常是无机盐缓冲溶液（如磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl盐缓冲溶液等）。
5）选择检测器：根据样品的化学性质和检测需求选择合适的检测器，如紫外-可见光（UV-Vis）、示差折光检测器（RI）或蒸发光散射检测器（ELSD），确定检测器的参数设置；偶尔也会联用。
6）选择分离条件：设定流速，通常在0.2-1.0 mL/min之间；设定柱温，以优化分离效果。
7）预料、识别和解决潜在问题：预料可能出现的问题，如柱堵塞、样品降解、峰形不佳等；识别问题的原因，如样品溶剂不兼容、流动相污染等；解决问题，如更换色谱柱、优化流动相组成、调整样品处理方法等。
8）进行方法的部分验证和系统稳定性测试：进行系统适用性测试，包括理论板数、拖尾因子和分离度；进行部分方法验证，包括准确度、精密度、线性范围、检测限和定量限、耐用性；测试系统稳定性，包括连续运行条件下的系统变异性。
9）优化和调整：根据初步实验结果，优化分离条件，如调整缓冲盐比例、流速或柱温；调整检测器参数，以提高灵敏度和选择性。
10）最终验证：进行全面的方法验证，包括交叉验证和独立实验室验证；确定方法的可靠性和重现性。

图1.SEC方法开发的一般步骤

02.SEC方法开发的调整考量

1）流速的优化

a. 分辨率与流速的关系：在尺寸排阻色谱中，降低流速可以提高分辨率，因为这有助于减少扩散和提高分子在柱内的停留时间，从而实现更好的分离。然而，较低的流速也会增加分析时间，因此需要在分辨率和分析效率之间找到平衡。

b. 系统压力与流速的关系：较高的流速可能会增加系统压力，特别是当使用较长的柱子或较小的粒径的填料时。系统压力的增加可能导致泵性能下降或柱子损坏，因此需要监控并优化流速以保持在系统的压力限制内；SEC色谱柱耐压一般都较小。

c. 样品性质与流速的关系：不同的样品可能需要不同的流速来实现最佳分离。例如，对于较大的蛋白质或聚合物，可能需要较高的流速来减少扩散和保持合理的分析时间。

2）柱温的优化

a. 保留时间与柱温的关系：理论上，在SEC中温度对保留时间没有影响，因为SEC分离是基于熵驱动的分配过程，而非吸附过程。然而，在实际操作中，温度可能会通过改变蛋白质的构象间接影响保留时间。

b. 流动相粘度与柱温的关系：温度的升高通常会降低流动相的粘度，从而增加分子在柱内的扩散性。这可能会影响分离效率和分辨率。

c. 分析时间与柱温的关系：在某些情况下，提高柱温可以减少分析时间，但这可能会以牺牲分辨率为代价。

d. 系统压力与柱温的关系：提高柱温通常会降低流动相的粘度，从而降低系统压力，但在实际操作中，如果柱温升高导致样品的溶解度降低或色谱柱的性能下降，可能会间接增加系统的压力。SEC分离通常在10~30℃下进行。

e. 样品稳定性与柱温的关系：在方法开发过程中，需要确保所选的柱温不会影响样品的稳定性，特别是在分析温度敏感的生物分子时。

3）流动相的优化

a. 缓冲盐组成与流动相的关系：流动相通常由水相缓冲液组成，如磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，常与氯化钠等盐类配合使用。有时，对于特定的生物分子，可能还会添加有机溶剂，如乙腈或甲醇。优化缓冲液和盐浓度是最大程度提高色谱柱分离效果的关键部分，其目的在于避免造成峰拖尾、峰变形、分离度不佳的次级相互作用以及由流动相引起的蛋白质聚集。

b. 离子强度与流动相的关系：调整流动相的离子强度可以减少填料与蛋白质之间的次级相互作用。例如，增加氯化钠的浓度可以减少单体的峰拖尾现象并使峰形更窄。

c. pH与流动相的关系：流动相的pH值对蛋白质的电荷状态和因此与其与填料的相互作用有显著影响。选择合适的pH值可以优化蛋白质的分离。

d. 缓冲液浓度与流动相的关系：缓冲液的浓度也会影响蛋白质的分离。过高的缓冲液浓度可能导致蛋白质聚集，从而影响分析结果。通常，较低的缓冲液浓度有利于获得更好的分离效果。

图2.不同 NaCl 浓度下的 IgG 色谱图

03.SEC方法开发的注意事项
1）流动相的组成：选择合适的流动相组成，如水/盐溶液的比例，以确保样品的溶解性和稳定性。流动相的粘度和pH值对分离效果有显著影响。
2）检测器的选择：根据样品的特性选择合适的检测器，如紫外-可见光、荧光或示差折光检测器，并确保检测波长适合样品且流动相无吸收。
3）流速的选择：流速会影响分离度和分析时间。通常，降低流速可以提高分离度，但会增加分析时间。在满足分离度的前提下，适当提高流速可以缩短分析时间。
4）柱温的选择：柱温对样品的溶解度和稳定性有影响。升高柱温可以减少流动相的粘度，提高柱效，但也可能影响样品的构象。选择适宜的柱温以保持蛋白质的天然构象和避免变性
5）色谱柱的选择：根据样品的分子量范围选择合适的色谱柱孔径和粒径，以确保有效的分离。

总结一下：在开发SEC方法时，我们通常需要考虑以下几个关键点：首先，得根据样品的分子量和溶解性来挑选合适的溶剂和色谱柱。接着，对样品进行适当的预处理，以确保它们在分析过程中保持稳定。选择合适的流速和柱温也很重要，这两者都会影响分析时间和分辨率。此外，流动相的组成，包括缓冲液的类型和浓度，需要适当调整，以减少样品与柱填料之间的次级相互作用。最后，选择一个适合样品特性的检测器，确保它能够在所需的波长下有效检测。在整个过程中，我们还得留意系统的压力限制，避免过高的压力损坏色谱柱。简而言之，SEC方法开发虽然相对简单，但每一步都需要细致的考量和优化，以确保获得高质量的分析结果。