主题：【分享】高效液相色谱|离子交换色谱法的小知识

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发表于：2024/10/15 13:00:35 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

离子交换色谱法（Ion Exchange Chromatography，简称IEC）是一种基于离子交换原理的分离技术，广泛应用于生物大分子如蛋白质、核酸以及小分子如氨基酸和离子的分离纯化过程。其核心原理是利用固定相离子交换剂上的电荷基团与流动相中的离子进行可逆的离子交换，实现样品中不同组分的分离。在离子交换色谱中，固定相通常是带有电荷的树脂或纤维素，这些基质通过化学反应引入了电荷基团，形成阳离子或阴离子交换剂。阳离子交换剂带有负电荷，用于吸附带正电的离子；而阴离子交换剂带有正电荷，用于吸附带负电的离子。离子交换剂可以分为强离子交换剂和弱离子交换剂，它们的电荷基团具有不同的解离常数，影响着离子的交换能力。流动相是IEC中的另一个关键要素，它通常为含盐的缓冲水溶液，可以通过改变其离子强度、pH值或组成来调节样品组分的保留行为。例如，增加流动相的离子强度可以增强与样品离子争夺离子交换官能团的能力，减弱样品组分与离子交换树脂的亲和性，从而实现洗脱。
01.离子交换色谱分离的原理是什么？

答：离子交换色谱的分离原理是利用带有相反电荷的离子交换剂作为固定相，与样品中的离子通过电荷相互作用发生可逆的离子交换，通过改变流动相的离子强度或pH值调节样品组分与离子交换剂之间的结合力，实现不同电荷特性的样品组分在色谱柱中的选择性分离。

02.离子交换色谱分离的过程是什么？
答：1）平衡（Equilibration）：

在色谱分析开始之前，色谱柱需要在特定的缓冲溶液中达到平衡状态，以确保色谱柱上的离子交换剂具有一致的电荷状态。

平衡通常使用与流动相相同或相似的缓冲液进行，直到色谱图基线稳定，表明色谱柱已达到所需状态。

如：

阳离子交换剂带有负电荷（如磺酸基团 -SO3^-），吸附带正电的离子。

阴离子交换剂带有正电荷（如季胺基团 -NH3^+），吸附带负电的离子。

2）样品加载与冲洗（Sample Loading and Washing）：

样品在平衡后的色谱柱上进行加载，这一步骤需要小心操作，以避免对色谱柱造成物理损伤或过度加载样品。

加载样品后，可能需要使用流动相进行冲洗，以去除未与离子交换剂结合的样品组分，减少对色谱柱的污染。流动相是携带样品通过色谱柱的溶液，通常为含盐的缓冲水溶液。

流动相中的离子可以与固定相上的离子交换剂发生可逆的离子交换反应。

3）洗脱（Elution）：

当样品溶液进入色谱柱时，样品中的离子根据其电荷性质与固定相上的离子交换剂发生相互作用。

样品中的不同组分根据其与离子交换剂的相互作用强度被逐步洗脱。洗脱可以通过等度洗脱（使用单一浓度的缓冲液）或梯度洗脱（逐渐改变缓冲液的浓度或组成）来实现。

洗脱过程中，通过调整流动相的pH值、离子强度或组成，可以控制样品中各组分的洗脱顺序和分离效率。

4）再生（Regeneration）：

分离完成后，需要对色谱柱进行再生，以去除可能残留在柱上的样品组分，恢复色谱柱的性能。

再生通常使用高浓度的盐溶液或强酸/强碱溶液进行，以去除色谱柱上的所有残留离子，然后使用平衡缓冲液重新平衡色谱柱。

原理动画：https://www.bilibili.com/video/BV1Qw411Z7Re/?vd_source=55086ed2640f93c14350844eeb8bd5f5

03.常见的离子交换色谱柱有哪些？

答：强阳离子色谱柱、弱阳离子色谱柱、强阴离子色谱柱和弱阴离子色谱柱

1）强阳离子色谱柱（Strong Cation Exchange, S-CAX）：

使用强酸性离子交换剂，如磺酸基团。

在较宽的pH范围内（通常pH 2-12）保持带负电荷状态。

适用于分离带正电荷的样品，如碱性蛋白质。
2）弱阳离子色谱柱（Weak Cation Exchange, W-CAX）：使用弱酸性离子交换剂，如羧酸基团。电荷状态受pH影响较大，通常在pH 4-7之间带负电荷。适用于分离在特定pH下带正电荷的样品，如蛋白质的电荷异构体。
3）强阴离子色谱柱（Strong Anion Exchange, S-AEX）：使用强碱性离子交换剂，如季胺基团。在较宽的pH范围内（通常pH 1-14）保持带正电荷状态。适用于分离带负电荷的样品，如酸性多糖或某些蛋白质。
4）弱阴离子色谱柱（Weak Anion Exchange, W-AEX）：使用弱碱性离子交换剂，如胺基或酚基官能团。电荷状态受pH影响较大，通常在pH 6-9之间带正电荷。

适用于分离在特定pH下带负电荷的样品，如某些核苷酸和有机酸。

04.那常见的离子交换色谱柱洗脱顺序有什么规律？

答：1）强阳离子色谱柱（Strong Cation Exchange, S-CAX）：

使用强阳离子交换剂，如磺酸基团，能够在较宽的pH范围内保持带负电状态。在这种色谱柱中，通常首先洗脱的是带正电荷较多的碱性物质，随后是带正电荷较少的中性或酸性物质。具体顺序取决于样品的等电点（pI）和流动相的pH值。
2）弱阳离子色谱柱（Weak Cation Exchange, W-CAX）：

使用弱阳离子交换剂，如羧基官能团，其电荷状态受pH影响较大。在pH值高于其pKa时，交换剂带负电荷，能够保留带正电荷的样品。洗脱顺序通常是由电荷数量和pH值决定的，可能与强阳离子色谱柱有所不同，因为弱阳离子交换剂在pH值低于其pKa时会逐渐失去电荷。

3）强阴离子色谱柱（Strong Anion Exchange, S-AEX）：

使用强阴离子交换剂，如季胺官能团，通常在广泛的pH范围内保持带正电状态。在这种色谱柱中，带负电荷较多的酸性物质会先被洗脱，随后是带负电荷较少的中性或碱性物质。

4）弱阴离子色谱柱（Weak Anion Exchange, W-AEX）：使用弱阴离子交换剂，例如叔胺基官能团，其电荷状态受pH影响较大。在pH值低于其pKa时，交换剂带正电荷，能够保留带负电荷的样品。洗脱顺序通常是由电荷数量和pH值决定的，与强阴离子色谱柱相比，洗脱行为可能因pH的变化而有显著不同。

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