1）流速的优化 a.色谱柱的效率与流速的关系：在正相色谱中，流速会影响柱效，即理论塔板数（N）。存在一个最优流速范围，在此范围内色谱柱能够提供最高的分离效率。流速过低会增加扩散，导致柱效下降；流速过高则可能由于湍流效应而损失效率。 b. 流速与分离度的关系：流速的选择直接影响分离效果和分析时间。流速过快可能导致峰宽增加，从而降低分辨率；流速过慢则会造成分析时间过长。通过改变流速，可以改变色谱柱的效率，进而影响理论塔板数，并将这些数据与流速作图，以确定最佳流速 。 c.系统压力与流速的关系：流速的增加可能会导致系统压力增加，需要确保色谱系统和色谱柱能够承受相应的压力。在正相色谱中，通常使用高粘度的流动相，如己烷或异丙醇，这可能导致系统压力较高。因此，在选择流速时，需要考虑系统的工作压力限制 。 d. 样品性质与流速的关系：不同的样品可能需要不同的流速以实现最佳分离。例如，对于分子量较大或极性较强的样品，可能需要较低的流速以确保足够的保留和分离。而对于分子量较小或极性较弱的样品，则可能需要较高的流速以减少分析时间 。
2）柱温的优化
a.保留时间和分离效率与柱温的关系：柱温的变化会直接影响分析物在色谱柱中的保留时间。通常，提高柱温会减少分析物与固定相之间的相互作用，导致保留时间缩短。温度的升高也有助于降低流动相的粘度，进一步提高了溶质的扩散速度，从而影响分离效率和分辨率。 b. 样品的热稳定性与柱温的关系：样品的挥发性、热稳定性和化学性质等都会影响柱温的选择。对于热敏感的样品，需要避免在过高的温度下进行分析以防止样品降解。此外，一些样品可能在高温下出现结构修饰，从而影响分析结果。 c.流动相的粘度和溶剂强度与柱温的关系：柱温的升高会降低流动相的粘度，影响其溶剂强度，从而改变流动相与固定相之间的相互作用。这会改变分析物的保留特性和选择性，进而影响色谱峰的形状和分离度。 d. 系统压力和色谱柱的稳定性与柱温的关系：柱温的变化会影响流动相的粘度，进而影响系统压力。因此，在选择柱温时，需要考虑系统的工作压力限制和色谱柱的热稳定性，以避免超过系统的最大压力承受能力或损坏色谱柱。 3）流动相的优化 a.溶剂的极性与流动相的关系：选择合适的流动相极性是至关重要的，因为它直接影响分析物在色谱柱上的保留行为。在正相色谱中，通常使用非极性或弱极性的溶剂，如己烷、异辛烷或氯仿等，作为流动相的主要成分。流动相的极性应与分析物的极性相匹配，以实现有效的分离。 b. 溶剂的组成比例与流动相的关系：在正相色谱中，流动相的组成比例（例如，己烷与乙酸乙酯的比例）对分离选择性有显著影响。通过调整流动相中不同溶剂的比例，可以改变分析物的保留时间和分离度，从而优化色谱分离。 c.pH值与流动相的关系：对于具有酸碱性质的分析物，流动相的pH值会影响其电荷状态，进而影响保留时间。通过调节流动相的pH值，可以控制分析物的解离程度，优化分离。 d. 溶剂强度与流动相的关系：流动相中极性溶剂的比例可以调节洗脱能力，影响分析物的保留时间。在正相色谱中，增加极性溶剂的比例可以增强洗脱能力，减少分析物在柱上的保留。这种调整对于优化分离条件，特别是对于具有不同极性的分析物混合物，尤为重要。 e. 溶剂的兼容性与流动相的关系：流动相应与检测器兼容，确保检测灵敏度与信号稳定性。例如，如果使用紫外检测器，流动相在检测波长下应无吸收或吸收很小 。 05.NPC方法开发的注意事项 1）流动相的优化：流动相通常由非极性溶剂组成，如正己烷、氯仿等。流动相的极性应与分析物的极性相匹配，以实现有效的分离。 2）系统兼容性：在正相色谱中，需要注意整个液相系统应不含水和盐，因为含水过多会将硅胶成分洗脱出来。因此，在使用正相色谱时，需要将系统中的盐充分冲洗出系统，并且液相的洗针溶剂、洗泵阀的溶剂也需要更换成异丙醇等过渡溶剂。 3）色谱柱的选择：正相色谱通常使用硅胶柱，但也可以选用其他极性固定相，如CN基、Diol和氨基柱。硅胶柱由于其高比表面积和多孔性，是正相色谱中最常用的填料。 4）色谱柱的维护：正相色谱柱需要适当的活化和保存，以保持其性能。例如，硅胶柱可以直接用纯的正己烷保存，也可用异丙醇：正己烷（10:90）保存。一般不考虑用纯的异丙醇保存，因为异丙醇黏度较大，替换时间较久。
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