主题：【分享】高效液相色谱方法开发篇|关于亲和色谱（HILIC）的方法开发小知识

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发表于：2024/10/16 09:39:48 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

今天主要讲讲亲和色谱（HILIC）方法开发过程中的一般考量，HILIC与RP的方法开发相似度比较高，只是略有区别；HILIC利用极性固定相和以水为强洗脱溶剂的流动相，特别适合分析极性化合物，而RP则使用非极性固定相和以乙腈为强洗脱溶剂的流动相，更适合分析非极性到中等极性的化合物。

01.HILIC方法开发的一般步骤
1）色谱柱的选择：根据待分析样品的性质和分析要求，选择一个具有极性固定相的色谱柱，如未键合硅胶、酰胺基、氨基、二醇、两性离子、环糊精类、聚琥珀酰亚胺键合物质等。（HILIC色谱详细的原理请参见 高效液相色谱|亲水作用色谱法的小知识 https://bbs.instrument.com.cn/topic/8433314 ）
2）对样品进行预处理：由于HILIC中流动相通常含有较高比例的有机溶剂，因此需要确保样品能够在这种条件下溶解。对于难以溶解的大极性化合物，可能需要使用水、甲醇等大极性溶剂作为稀释剂。
3）选择色谱模式：HILIC模式；HILIC的流动相为极性更强的溶剂，如水、甲醇等。流动相中水的含量对保留行为有显著影响，一般至少需要3%的水以形成固定相表面的水层。流动相的pH值也会影响样品的电离状态和填料表面电荷，从而影响保留行为。通常，酸性化合物在高pH值下保留更强，而碱性化合物在低pH值下保留更好。另：在流动相中添加缓冲盐和添加剂可以改善峰型和保留。常用的缓冲盐包括甲酸铵和乙酸铵，它们在有机溶剂中具有良好的溶解性以及MS兼容性.
4）选择检测器：根据样品的性质选择合适的检测器，如紫外-可见光检测器（UV）、蒸发光散射检测器（ELSD）或质谱检测器（MS）。
5）选择分离条件：HILIC方法开发中，梯度洗脱是常用的手段，通过逐渐改变流动相的组成来实现样品的分离。梯度不能变化过快，需要留一定时间让色谱柱达到平衡。
6）预料、识别和解决潜在问题：预料可能出现的问题，如柱堵塞、样品降解、峰形不佳等；识别问题的原因，如样品溶剂不兼容、流动相污染等；解决问题，如更换色谱柱、优化流动相组成、调整样品处理方法等。
7）进行方法的部分验证和系统稳定性测试：进行系统适用性测试，包括理论板数、拖尾因子和分离度；进行部分方法验证，包括准确度、精密度、线性范围、检测限和定量限、耐用性；测试系统稳定性，包括连续运行条件下的系统变异性。
8）优化和调整：根据初步实验结果，优化分离条件，如调整洗脱梯度、流速或柱温；以提高方法的灵敏度和选择性。
9）最终验证：进行全面的方法验证，包括交叉验证和独立实验室验证；确定方法的可靠性和重现性。

02.HILIC方法开发的调整考量

1）流速的优化

a. 色谱柱的平衡与流速的关系：流速会影响色谱柱达到平衡的速度。较高的流速可能会缩短分析时间，但可能导致色谱柱平衡不充分，从而影响重现性和峰形。通常，需要使用足够的水来更新固定相表面的水层，以实现快速再平衡。所以在每一针完成后的方法中需要给予一段时间进行初始平衡。

b. 样品的溶解度与流速的关系：在HILIC中，样品通常需要在有机溶剂中溶解，如水和乙腈的混合物。流速的选择会影响样品在色谱柱上的保留和分离。如果样品在流动相中的溶解度有限，可能需要调整流速以确保样品能够有效地被输送到色谱柱上。

c. 峰形和分离度与流速的关系：流速对峰形和分离度有显著影响。较高的流速可能会改善峰形，但也可能降低分离度。因此，需要找到一个平衡点，以实现良好的峰形和足够的分离度。在某些情况下，可能需要使用较低的流速来优化分离度。

d. 检测器的兼容性与流速的关系：不同的检测器对流速的敏感性不同。例如，质谱检测器可能对流速有特定的要求，以确保最佳的离子化效率。因此，在选择流速时，需要考虑检测器的特性和要求。

2）柱温的优化

a.保留时间与柱温的关系：柱温的变化会影响分析物与固定相之间的相互作用，进而影响保留行为。根据van’t Hoff方程，温度的升高通常会导致保留因子（k）的降低，因为色谱过程中的相互作用通常是放热的（ΔH°为负值）。这意味着随着柱温的升高，保留时间可能会减少，从而影响分离效果。b. 色谱分离效率柱温的关系：提高柱温通常可以降低流动相的粘度，增加分析物的扩散性，从而提高色谱效率。较低的粘度和较高的扩散性有助于减少峰宽，提高分离度和分辨率。
c. 溶剂和缓冲液的选择与柱温的关系：柱温的优化还需要考虑溶剂和缓冲液的物理化学性质，包括它们在不同温度下的溶解度和稳定性。例如，某些缓冲盐在低温下可能无法完全溶解，而在高温下可能会分解。
d. 系统压力和色谱柱的稳定性与柱温的关系：柱温的变化会影响流动相的粘度，进而影响系统压力。因此，在选择柱温时，需要考虑系统的工作压力限制和色谱柱的热稳定性，以避免超过系统的最大压力承受能力或损坏色谱柱。

3）流动相的优化

1）溶剂的组成与流动相的关系：HILIC的流动相通常由水和有机溶剂（如乙腈或甲醇）混合而成。水的比例通常在3%到40%之间，以确保在极性固定相表面形成水膜，这是HILIC保留机制的基础。水的比例不低于3%是因为水在HILIC色谱中被吸附形成水膜，分析物在水膜和流动相之间进行液液分配作用。
2）缓冲液的兼容性与流动相的关系：在HILIC中，缓冲液必须在有机溶剂中具有较高的溶解度。常用的缓冲液包括甲酸盐或乙酸盐，因为它们具有挥发性，这对于与质谱联用时的离子化非常重要。应避免使用在有机溶剂中溶解度差的缓冲液，如磷酸盐缓冲液，因为它们可能会在色谱柱中析出。
3）pH值的调节与流动相的关系：流动相的pH值会影响样品的电离状态，从而影响保留行为。通常，酸性化合物在高pH值下保留更强，而碱性化合物在低pH值下保留更好。因此，流动相的pH值需要根据分析物的pKa值进行优化，以确保样品在色谱柱上适当的保留和分离。

03.HILIC方法开发的注意事项：
1）色谱柱的选择：根据分析物的属性选择适当的色谱柱。色谱柱的选择应基于分析物的极性（如对数正辛醇/水分配系数，log D）和pKa值。
2）流动相的选择：流动相通常由高比例的有机溶剂（如乙腈）和少量的水或水溶性缓冲液组成。至少需要3%的水来保持固定相的水合作用。流动相的组成、pH值和是否使用缓冲液都是需要优化的因素。
3）系统兼容性：HILIC系统与RPLC系统在仪器上相似，但在方法开发时需要考虑HILIC特定的条件，如流动相的组成和缓冲液的使用。
4）有机溶剂含量的调整：流动相中有机溶剂的含量是控制分析物保留的主要因素。增加有机溶剂的比例通常会增加分析物的保留。
5）避免使用高比例水的流动相：在HILIC中，应避免使用高比例水的流动相，因为这可能导致分析物保留不足。
6）梯度洗脱的注意事项：在HILIC中，梯度洗脱应从高比例的有机溶剂开始，而不是从100%的水开始。建议的梯度范围是从97%到60%的有机溶剂。

总结一下：

开发亲和色谱（HILIC）方法时，有几个关键点需要特别注意：

首先，得挑个适合极性化合物的色谱柱，比如未键合硅胶或者酰胺基柱。接着，样品预处理得跟上，确保样品能在含有机溶剂的流动相中溶解。流动相的调整也比较讲究，通常得用水和有机溶剂混合，保持至少3%的水含量来形成固定相表面的水层，还得注意pH值，因为这会影响样品的电离状态。检测器的选择得看样品特性，UV、ELSD或MS都行，但得确保和流动相合得来。分离条件，比如梯度洗脱，需要逐渐调整流动相的组成，还得给色谱柱足够的时间平衡。

过程中可能会遇到各种问题，比如峰形不好或者柱子堵了，这时候就得及时找出问题并解决。最后，别忘了方法验证和色谱柱的维护，确保方法的稳定性和重现性。

总的来说，HILIC方法开发需要耐心和细致的调整，但一旦调好了，就能得到非常可靠的分析结果。

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