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主题：【讨论】牛乳中β-内酰胺酶检测方法——高效液相色谱法

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发表于：2010/02/10 09:36:24 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

我收集了一点资料，希望大家来评价此方法

1、间接法

方法原理：
　　利用β-内酰胺酶能够酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定浓度的β-内酰胺酶，那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度会减少，从而判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶。

实验步骤：
　　称取20 g试样，在4℃、16000rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑离心管，并将塑料离心管置于37℃水浴锅中振荡孵育30 min。向孵育后的离心管中加入无水乙醇15mL。振荡提取30 min后离心，将上层清液过滤纸后收集于梨形瓶中。减压浓缩蒸发掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸盐缓冲液（pH=8.5），涡旋1 min后调节pH为8.5。以1 L/min的速度将提取液通过经过预处理的Oasis HLB固相萃取柱，用2 mL磷酸缓冲液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2 mL水淋洗。最后用3 mL乙腈洗脱。将洗脱液在40℃下氮气吹干，用0.025 M磷酸盐缓冲液（pH=7.0）定容残渣至1 mL,待上机测定。

色谱条件：色谱柱 Agilent Zorbax SB C18，4.6mm×150mm×5μm；
流动相甲醇/0.004 M磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60；
检测波长 268 nm

讨论：
　　该方法只能给出定性结论即牛奶中是否含有β-内酰胺酶，而无法给出确切定量结果即牛奶中含有β-内酰胺酶的量（U/ml）；前处理方法相对复杂、费时。

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2010/2/10 9:37:46 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

2、直接法

方法原理：
　　牛乳中的青霉素钾在β-内酰胺酶的作用下，主要生成青霉噻唑酸钾，并伴随生成少量的青霉胺、青霉醛等物质。经去脂肪、蛋白等前处理后，可以将青霉噻唑酸钾提取出来，经高效液相色谱仪检测确认其是否存在，从而判定该牛乳是否为人造“无抗奶”。

实验步骤：
　　称取20 g试样，在4 ℃、16000 rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管，加入无水乙醇15 mL，振荡提取30 min后离心，取清液经0.45 μm的滤膜过滤，用高效液相色谱仪检测。
标准溶液配制：称取0.01 g（精确至0.001 g）青霉素钾于100 ml容量瓶中，加入1ml市售抗生素分解剂，室温放置2h使青霉素钾酶解完全后用去离子水定容，得到青霉噻唑酸钾标准溶液，浓度100 μg/mL。根据实际情况稀释后使用。

色谱条件：色谱柱 Agilent Zorbax SB C18，4.6mm×150mm×5μm；
流动相甲醇/0.004 M磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60；
检测波长 230 nm

讨论：
　　该方法通过检测酶解产物青霉噻唑酸，只能给出定性结论即牛奶中是否含有β-内酰胺酶，而无法给出确切定量结果即牛奶中含有β-内酰胺酶的量（U/ml）；青霉噻唑酸钾稳定性尚需进一步考；实验成本较生物学方法高。

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