主题：【第三届原创参赛】TOF也来做定量（11月）

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lansusie

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发表于：2010/10/25 17:39:19 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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一直以来从事定量分析首选的仪器就是三重四级杆，本文尝试使用飞行时间质谱来做一些定量分析的工作。在满足高精度检测的同时在定量准确性方面得到了较好的检测结果。文章标题为
《超高效液相色谱-飞行时间质谱联用法测定人血浆中单硝酸异山梨酯》

目的：建立超高效液相色谱-飞行时间质谱联用法测定人血浆中单硝酸异山梨酯浓度。方法：应用ACQUITY UPLC Hss T3色谱柱（1.8μm 2.1×50mm），以乙腈-0.1%甲酸水为流动相，梯度洗脱进行分离，流速0.5mL/min。采用飞行时间质谱检测器，大气压电喷雾离子源(ESI)，负离子全扫描检测。结果：单硝酸异山梨酯的线性范围为20～1000ng/mL，提取回收率为98.64～108.98 %，日内、日间相对标准差RSD<15%。结论：方法灵敏、快速、重现性好，可用于临床血药浓度监测和药动学研究。

单硝酸异梨酯（Isosorbide-5-mononitrate,5-ISMN）为抗心肌缺血药硝酸异山梨酯（5-ISDN）体内主要活性代谢产物，其主要药理活性是松弛平滑肌，与5-ISDN相比，单硝酸异山梨酯具有吸收迅速、无首过效应、生物利用度高等特点，成为新一代硝酸酯类药。临床上主要用于预防心绞痛，在治疗充血性心力衰竭和血管痉挛性心绞痛等方面应用也日益广泛，疗效优于5-ISDN及硝酸甘油(nitroglycerin, NG)缓释剂。研究表明，5-ISMN血浆t_½长，生物利用度高，个体差异小^[1]。有关单硝酸异山梨酯血药浓度的测定方法，国内外报道主要有气相色谱法、高效液相色谱法和液-质联用法等，本试验以超高效液相色谱-飞行时间质谱联用法测定血浆中单硝酸异山梨酯浓度，拟建立一种高灵敏度、高效率的测定方法，用于临床血药浓度监测及药动学研究。

1 材料与方法

1.1 仪器

美国WATERS公司ACQUITY UPLC-LCT Premier XE液相色谱-飞行时间质谱联用仪，ESI离子源，QUANLYNX数据处理系统，ASONE TM-2F微型旋涡混合仪（日本ASONE）；VP30真空抽滤泵（北京莱伯泰科）；超高速离心机（长沙平凡科学仪器厂）；氮气吹干仪（杭州奥盛）；JK-3200DB超声波清洗机（合肥金尼克）。

1.2 试剂

乙腈 HPLC（TEDIAK公司）；甲酸 HPLC（TEDIA公司）；乙酸乙酯 AR（西陇）；二氯甲烷 AR（西陇）；超纯水 (MILLI-Q-Reference) 等。

单硝酸异山梨醋对照品批号（100694-200401）对乙酰氨基酚品对照品（100018-200408），由中国药品生物制品检定所提供，空白人血浆由安徽医科大学附属医院血液科提供。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

1.3.1.1 单硝酸异山梨酯储备液

准确称取干燥至恒重单硝酸异山梨酯对照品适量，置于50mL容量瓶中，用乙腈溶液溶解并稀释，得到一定浓度的单硝酸异山梨酯储备溶液，由于该物质在溶液中不稳定，故现制现用。

1.3.1.2 内标对乙酰氨基酚溶液

精密称取对乙酰氨基酚对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用20:80=乙腈：水溶解并稀释，得到浓度为200µg/mL的对乙酰氨基酚储备溶液。稀释成浓度为1µg/mL的溶液作为内标溶液。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC Hss T3 1.8μm 2.1×50mm；流动相：0.1%甲酸水溶液，乙腈；梯度洗脱，梯度条件见表1；流速0.5mL/min；柱温：30℃；进样量：10µL。

表1 梯度条件

Tab 1 The conditions of the gradient

时间/min （time）	流动相比例（rate of mobile phase）
时间/min （time）	0.1%甲酸水溶液 (0.1%Formic acid liquid)	乙腈（Acetonitrile）
0	90	10
2	10	90
2.5	10	90
3	90	10

1.3.3 质谱条件

离子源为ESI源；毛细管电压2500V；毛细管温度：350℃；干燥气流速：600L/hr；辅助气流速：10 L/hr；负离子V模式检测；扫描范围：m/z100~1000。单硝酸异山梨酯与对乙酰氨基酚在ESI离子化方式下，主要生成 [M+HCOOH]^-和[M-H]^-分子离子峰，分别为m/z 236.04和m/z150.05。

1.3.4 血浆样品处理

精确量取200μL血浆，加入内标对乙酰氨基酚标准溶液（1000ng/mL）20μL，涡旋1min。加入3000µL乙酸乙酯：二氯甲烷=80：20的溶液，涡旋1min，4000rpm离心5min，提取上层有机相2550μL，40℃下N2吹干，200μL流动相复溶，12000rpm离心5min，取上清液进样。

2.结论

用UPLC-ToF-MS法测定健康受试者血浆中单硝酸异山梨酯浓度，血浆中杂质峰不干扰样品的测定，线性范围：20～1000ng/mL，最低可定量浓度20ng/mL，提取回收率为98.64～108.98 %，基质效应：94.54～107.70%，批内和批间精密度及准确度的RSD均小于15%，且血浆在室温进样、冻融、长期冷冻下稳定性良好。所以该方法符合单硝酸异山梨酯血浆样品分析要求。

3 讨论

血浆中单硝酸异山梨酯检测方法国内外有HPLC、GC、LC-MS法，但这些方法有的灵敏度不高，有的分析样品时间较长。本实验采用UPLC-TOF-MS对血浆中单硝酸异山梨酯含量进行检测，UPLC的使用缩短了样品的分析时间，每个样品仅需3min，提高了分析效率，进而大大减少了溶剂的使用量，节约检测成本；同时TOF-MS高分辨质谱的使用，在保证高灵敏度的前提下，提高了检测准确性。因此，本方法适用于临床血药浓度监测及药动学研究。