口蹄疫病毒荧光定量PCR检测方法的模块化构建及实践

1 前言

口蹄疫俗名“口疮”、“辟癀”，是由口蹄疫病毒所引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。主要侵害偶蹄兽，偶见于人和其他动物，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类传染病之首，我国原农业部将其列为一类动物疫病。目前，有三分之二的 OIE 成员国流行 FMD，时刻威胁着无 FMD 国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。

口蹄疫病毒属于小RNA病毒科口疮病毒属，其最大颗粒直径为23纳米，最小颗粒直径为7~8纳米。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个血清型（A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型），并可细分为65个以上亚型。

该病毒对外界环境的抵抗力很强，在冷冻情况下，血液及粪便中的病毒可存活120~170天。阳光直射下60分钟即可杀死；加温85℃15分钟、煮沸3分钟即可死亡。对酸碱之作用敏感，故1%~2%氢氧化钠、30%热草木灰、1%~2%甲醛等都是良好的消毒液。

牛尤其是犊牛对口蹄疫病毒最易感，骆驼、绵羊、山羊次之，猪也可感染发病。本病具有流行快、传播广、发病急、危害大等流行病学特点，疫区发病率可达50%~100%，犊牛死亡率较高，其他则较低。病畜和潜伏期动物是最危险的传染源。病畜的水疱液、乳汁、尿液、口涎、泪液和粪便中均含有病毒。该病入侵途径主要是消化道，也可经呼吸道传染。本病传播虽无明显的季节性，且春秋两季较多，尤其是春季。风和鸟类也是远距离传播的因素之一。

口蹄疫病毒属于RNA病毒，非常容易发生变异，原因是由于病毒RNA是单链结构，容易断裂而发生重新组合，自身稳定性差，加之在复制过程中修复错误机制的酶活性较低，因而导致RNA病毒变异很快。

为确保公共卫生安全，以及畜牧业健康发展，有必要实施口蹄疫病毒核酸监测，尽早发现疫情隐患并予以及时处置，避免重大动物疫情及公共卫生安全事件发生。

2 模块化检测方法思路

总体思路是：将动物疫病荧光定量PCR检测分为三个模块，核酸提取采用DNA/RNA共提试剂，核酸扩增采用预混液+引物探针方式，质控品利用抗原或商品化疫苗自制。具体思路如下：

——核酸提取采用DNA/RNA共提试剂；

——引物探针严格按照标准方法，委托生物工程公司合成；

——反应体系中其他成分，采购商品化RT-qPCR预混液（含逆转录酶）；

——质控品：阳性对照采用病毒抗原、商品化疫苗等，测定结果后按一定比例稀释，保存备用。

——反应体系：设为20μL，其中包含：预混液（2×）10μL、逆转录酶1μL、ROX 0.4μL为固定量，引物探针加入量根据检测标准中的终浓度予以换算，加灭菌水补足18μL，RNA模板为2μL；

——反应条件首先按照标准中的条件开展摸索，如达到预期效果则予以固定；如效果不佳则参照预混液及引物探针推荐条件进行适当调整。

3 材料和方法

3.1 病毒

口蹄疫抗体液相阻断ELISA试剂盒附带的抗原，包括O型、亚洲I型和A型。

3.2 试剂

DNA/RNA共提试剂盒：FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit试剂盒，南京诺维赞生产；

RT-qPCR预混液：2× One Step Q Probe Mix，南京诺维赞生产；

逆转录酶：One Step Q Probe Enzyme Mix，南京诺维赞生产。

3.3 引物探针

按照GB/T18935-2018《口蹄疫诊断技术》提供的序列，委托上海生工合成，引物稀释成10μmol/L、探针稀释成5μmol/L，分装成小包装冷冻保存备用。具体序列如下：

正向引物：5’-ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA-3’

反向引物：5’-GCGAGTCCTGCCACGGA-3’

探针：5’-FAM-TCCTTTGCACGCCGTGGGAC-BHQ1-3’

3.4 反应体系

根据GB/T18935-2018《口蹄疫诊断技术》所载反应体系，按照终浓度一致原则予以转化。具体转换方法：

——反应体系总体积设定为20μL；

——将标准中反应体系的10×PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq酶、反转录酶等成分转换为RT-qPCR预混液10μL、逆转录酶1μL（推荐量）；

——因使用ABI7500荧光PCR仪，故在体系中加入ROX 0.4μL；

——标准中正向引物、反向引物、探针的终浓度分别为0.2μmol/L、0.2μmol/L和0.2μmol/L，故在修改后的体系中加入量为0.4μL、0.4μL和0.4μL；

——总RNA加入量修改为2μL（根据经验该加入量已经足够）；

——根据上述各成分用量，补充体积的无核酸酶水修改为5.4μL。

GB/T18935-2018		修改方法
2Χ一步RT-PCR缓冲液	10	2Χ RT-qPCR预混液	10
TAKARA EX Taq HS（5U/μL）	0.4	酶混合液	1
PrimeScript RT Enzyme Mix II	0.4	ROX	0.4
正向引物（10μmol/L）	0.4	正向引物（10μmol/L）	0.4
反向引物（10μmol/L）	0.4	反向引物（10μmol/L）	0.4
探针（5μmol/L）	0.8	探针（5μmol/L）	0.4
无核酸酶水	6	无核酸酶水	5.4
总RNA	1.6	总RNA	2
总体积	20	总体积	20

3.5 反应条件

参照GB/T18935-2018《口蹄疫诊断技术》推荐的扩增程序，结合ABI7500荧光采集时间不能少于34s的要求，进行预试验。扩增程序如下：

42℃15min→(95℃10s→55℃30s→72℃34s)*40

如扩增结果理想，则不做修改直接采纳，否则进行适当调整。

4 试验结果

对口蹄疫病毒包括O型、亚洲I型和A型等毒株进行核酸检测，结果均较理想。部分扩增曲线如下：

口蹄疫O型抗原扩增曲线

口蹄疫亚洲I型抗原扩增曲线

口蹄疫A型抗原扩增曲线

5 阳性质控的制备

根据GB/T18935-2018《口蹄疫诊断技术》规定，阳性对照应Ct<25。对O型、亚洲I型和A型3种抗原适当稀释后进行再次检测，结果如下：

稀释倍数	1:10^1	1:10^2	1:10^3	1:10^4
H5Re-8抗原	17.53	21.35	25.81	30.43
H5Re-11抗原	12.45	15.96	19.70	24.65
H5Re-12抗原	13.57	16.98	20.85	25.41

经综合判定，最后采用口蹄疫亚洲I型抗原作1: 10^3稀释，分装为200μL/管作为阳性质控，Ct值约20，-70℃冻存备用。

6 讨论

6.1 检测工作更加方便高效

一是在核酸提取环节采用了DNA/RNA共提试剂，待检样品经一次提取核酸，除可应用于口蹄疫、蓝耳病等RNA病毒项目检测外，还可应用于非洲猪瘟、圆环病毒等DNA病毒项目检测；

二是由于实验室储备了足够量的qRT-PCR预混液及逆转录酶，在开展检测时，不必担心部分检测量较少的项目由于试剂组分不足而罢工事件的发生；

三是由于qRT-PCR预混液及逆转录酶适用于多数RNA病毒项目的检测，在检测任务发生重大变化时，可以方便地调整检测项目，不必担心试剂不足或浪费情况的发生；

6.2 阳性质控品制备方便

动物疫病监测实验室常备口蹄疫液相阻断ELISA抗原，只需对贮存的抗原进行含量测定，取合适的抗原进行一定比例的稀释即可作为实验室内部的阳性质控品。

6.3 适用性有待进一步验证

尽管在构建新方法时，对适用性进行了尽可能多的验证，但对于其他毒株，尤其是较新型的变异株是否有效，尚有待进一步观察和验证。

6.4 严格依法依规操作

如果有关法律法规或上级有关部门出台政策，要求采用获批准的成品试剂盒用于检测，则实验室必须及时停止自建方法的使用。