主题：【分享】【金秋计划】荆防颗粒增强免疫作用机制研究

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发表于：2024/09/05 14:57:18 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

荆防颗粒由荆芥、防风、羌活、独活、柴胡、前胡、川芎、枳壳、茯苓、桔梗和甘草11味中药组成，主要功效为发汗解表、散风祛湿，主治外感风寒湿邪，用于风寒感冒、头痛身痛^[1]。现代药理研究证实，荆防颗粒具有解热、抗炎和镇痛作用^[2]。荆防颗粒由荆防败毒散优化而来，临床研究表明，荆防败毒散能缓解咳喘、发热、疼痛等作用，调节细胞免疫和炎症因子，提高机体免疫系统功能^[3]。但荆防颗粒对于机体免疫系统的作用靶点与作用机制尚不明确，其次，荆防颗粒在临床应用中的安全性、有效性和剂量相关性等方面尚存在争议。此外，荆防颗粒的药效学特性、质量控制标准以及其在不同疾病治疗中的应用范围等方面也尚不明确。因此，本研究从多个层面探讨荆防颗粒的免疫调节活性及其作用机制。

斑马鱼幼鱼以先天免疫存活，适应性免疫系统在4～6周后逐渐成熟^[4]。幼鱼在感染炎症初始阶段，中性粒细胞最先对损伤作出反应；随后巨噬细胞被召集到炎症组织，吞噬病原体和组织碎片。T淋巴细胞简称T细胞，是来源于骨髓的淋巴干细胞，前体T细胞最早在肾脏骨髓里被发现，随后在胸腺中分化、发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥免疫功能^[5]。γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）又称免疫干扰素，由活化T细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）产生，可以激活巨噬细胞，诱导辅助性T细胞（T helper cells，Th1）细胞分化并抑制Th2细胞分化，增强机体免疫能力。因此本研究建立斑马鱼幼鱼免疫低下模型，通过中性粒细胞数目、巨噬细胞荧光强度及T细胞荧光强度为评价指标，初步评价荆防颗粒增强免疫作用。本研究同时建立环磷酰胺免疫低下小鼠模型，以脏器指数、细胞因子、血清免疫球蛋白等指标结合脾组织中免疫相关基因表达情况探讨荆防颗粒免疫调节机制，为荆防颗粒调节免疫作用临床应用提供科学依据。
雷帕霉素是一种大环内酯类化合物，具有免疫抑制作用，主要通过抑制TLR4/MyD88信号通路及其下游的蛋白激酶活性而起作用^[8]。长春瑞滨是一种半合成的长春花生物碱细胞毒类化疗药，研究表明，大剂量长春瑞滨骨髓抑制明显，会导致血小板、红细胞和白细胞（中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞等）数目减少，最终诱导免疫力低下^[9]。环磷酰胺是一种强效免疫抑制剂，在体内可被肝细胞微粒体羟化，产生的代谢产物具有烷化作用，干扰DNA合成，抑制细胞增殖，发挥免疫抑制作用；环磷酰胺还可减弱B淋巴细胞功能，抑制B细胞分泌相关抗体，抑制T细胞介导非特异性免疫反应和细胞免疫，进而减少免疫复合物聚集和细胞因子释放^[10]，导致机体整体免疫功能障碍。本研究采用雷帕霉素及长春瑞滨建立斑马鱼免疫低下模型，环磷酰胺建立小鼠免疫低下模型。免疫器官指数是评价机体免疫力的一项重要指标，能反映身体免疫反应的水平，脾、胸腺是机体的免疫器官，具有免疫功能，其中脾是免疫细胞储存的场所，主要参与机体的体液免疫；脾脏中含有大量NK细胞、巨噬细胞和淋巴细胞，其中NK细胞通过分泌TNF-α、IFN-γ等细胞因子发挥免疫调节作用^[11]。胸腺是T细胞成熟的场所，通过影响机体T淋巴细胞的增殖进而参与机体的细胞免疫^[12]。研究发现，环磷酰胺致小鼠免疫低下后，脾脏及胸腺免疫器官均受到了损伤，表现为脏器指数较空白组显著降低，而荆防颗粒治疗后可以显著改善免疫器官损伤，帮助免疫功能恢复。IL-2是一类由活化的T细胞分泌产生的糖蛋白，具有抗感染、抗病毒等功效，能够提高动物机体的免疫功能。IL-2不但能诱导T淋巴细胞增殖和分化，还能刺激已活化的B细胞增殖，促进B细胞分泌免疫球蛋白^[13]。TNF-α是免疫系统的产物，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，也由淋巴细胞和NK细胞产生，在免疫反应中发挥多种作用，可激活淋巴细胞及中性粒细胞，增加血管内皮通透性，诱导并促进其他炎性因子释放，加剧炎症反应^[14]。免疫球蛋白是机体在抗感染方面的重要屏障，IgG、IgM是活化B淋巴细胞产生的主要免疫球蛋白，可反映机体的体液免疫功能。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，是主动免疫后机体产生的主要抗体，在体液免疫中最为重要。IgM是血清中相对分子质量最大的免疫球蛋白，在初次免疫中占有重要地位，在机体防御机制中发挥抗感染作用，其在血清中的含量能体现机体的体液免疫功能。恢复IgG和IgM含量可以增强机体的体液免疫^[15]。本研究发现，环磷酰胺致小鼠免疫低下后，体内免疫相关细胞因子及免疫球蛋白含量均减少，而荆防颗粒治疗后可以显著提高其含量，增强机体的体液免疫。NF-κB通路在固有免疫和适应性免疫中都发挥着重要作用，通过模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）时开始激活、使其受体改变，活化IκB激酶α（IκB kinase α，IKKα），IKKα磷酸化IκBα，致IκBα活化解离，自由的NF-κB立即从胞质入核、开启基因转录过程，当TLR4识别到配体后，迅速与接头蛋白MyD88结合^[16]，白细胞介素-1受体相关激酶-1（interleukin-1receptor-associated kinase-1，IRAK-1）被磷酸化且与TRAF-6形成复合物，激活IκB激酶复合物，诱导IκBα和NF-κB p65亚基磷酸化，使p65/p50-IκBα聚合态解离，游离态p-NF-κB p65核转位后能够促使相关炎症细胞因子合成并释放，诱发炎症和免疫应答^[17]。已有研究报道，TNF-α、IL-1β基因的启动子均存在NF-κB的相应结合位点，这些因子表达受NF-κB活性的调控。本研究发现荆防颗粒能够使免疫低下小鼠血清中细胞因子IL-2、TNF-α的含量升高，说明荆防颗粒可能是通过激活NF-κB信号通路来调节机体的免疫功能。因此本研究选取了NF-κB信号通路中TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB p65、p-IκBα、p-NF-κB p65几个关键的靶点进行分析，发现荆防颗粒可以显著降低TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IκBα、p-NF-κB p65 mRNA的表达，说明荆防颗粒的免疫调节活性是通过NF-κB信号通路实现的。本研究通过建立斑马鱼免疫低下模型，首次从模式生物角度证明荆防颗粒具有免疫调节活性。结果显示，荆防颗粒可以通过增加雷帕霉素、酒石酸长春瑞滨导致的免疫低下斑马鱼体内中性粒细胞数目、巨噬细胞荧光强度、T细胞荧光强度以及体内细胞因子含量发挥增强免疫作用。同时，通过复制小鼠免疫低下模型，验证了荆防颗粒的免疫调节活性。荆防颗粒可以显著改善环磷酰胺致免疫低下小鼠免疫器官损伤，提高血清中IL-2、TNF-α及免疫球蛋白IgG、IgM含量。进一步机制研究发现，荆防颗粒通过降低脾脏中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IκBα、p-NF-κB p65 mRNA的表达，作用于NF-κB信号通路发挥增强免疫作用。本研究为荆防颗粒增强免疫的药理药效作用提供了科学依据和技术支持，同时也证实了模式生物斑马鱼作为药效评价手段的科学性和可信性。

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