2. 试剂与材料

除非另有说明，所有试剂均为优级纯，水为二级水。

2.1 甲醇：色谱纯。

2.2 乙酸乙酯：色谱纯。

2.3 甲酸：色谱纯。

2.4 柠檬酸溶液（0.1 mol/L）:准确称取21.02 g柠檬酸，用水溶解，定容至1 L。

2.5 磷酸氢二钠溶液（0.2 mol/L）:准确称取28.41 g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1 L，混匀后备用。

2.6 Mellvaine 缓冲液：将1000 ml 柠檬酸溶液（0.1 mol/L）与625 ml磷酸氢二钠溶液（0.2 mol/L）混合，用氢氧化钠或盐酸调节PH=4.0±0.05。

2.7 Na₂EDTA-Mellvaine 缓冲液（0.1 mol/L）：称取60.5 g乙二胺四乙酸二钠（Na₂EDTA·2H₂0）放入1625 ml Mellvaine 缓冲液中，使其溶解，摇匀备用。

2.8 甲醇+水（1+19）：量取5 ml甲醇与95 ml水混合。

2.9 甲醇+乙酸乙酯（1+9）：量取10 ml甲醇与90 ml乙酸乙酯混合。

2.10 甲酸水溶液（0.1%）：量取1 ml甲酸与1000 ml水混合。

2.11 标准物质：

物质	国家标准物质编号	浓度	标准物质来源
四环素	GSB05-3334-2016	100 μg/ml	农业部环境保护科研检测所
土霉素	GSB05-3333-2016	100 μg/ml	农业部环境保护科研检测所
金霉素	GSB05-3332-2016	100 μg/ml	农业部环境保护科研检测所
强力霉素	GSB05-3335-2016	100 μg/ml	农业部环境保护科研检测所

2.12 标准溶液

2.12.1 标准储备溶液：准确移取四环素、土霉素、金霉素、强力霉素各1ml，分别用甲醇定容至10 ml,储备液浓度分别为10 μg/ml，储备液在-18 ℃下贮存于棕色瓶中，可稳定3个月。

2.12.2混合标准工作溶液：移取四种10 μg/ml的储备液各100 μL，用0.1%甲酸水定容至1 ml,配置成1 μg/ml的混合标准工作溶液；再依次配置成20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L系列的混合标准工作溶液，混合标准工作溶液使用前配制。

3.样品前处理

称取均质试验5 g(精确到0.01 g),置于50 ml聚丙烯离心管中，分别用约20 ml、20 ml 0.1 mol/L EDTA-Mellvaine缓冲溶液冰水浴超声提取两次，每次涡混1 min，超声提取10 min，4000 r/min离心5 min(温度低于15 ℃)，合并上清液，并定容至50 ml，混匀，5000 r/min离心10 min(温度低于15 ℃)，用快速滤纸过滤，取10 ml滤液待净化。

4.净化与仪器条件

目标化合物	四环素/土霉素/金霉素/强力霉素
样品基质	猪肉
样品基质中主要干扰物及其他成分	油脂和蛋白
分析方法（参考标准）	GB/T 21317 动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法
具体操作步骤		溶剂		体积mL		流速		备注
	活化	甲醇		5		自然流速		/
	平衡	水		5		自然流速		/
	上样	样液		10		自然流速		/
	淋洗1	水		5		自然流速		/
	淋洗2	甲醇+水（19+1）		5		自然流速		/
	洗脱	甲醇+乙酸乙酯（1+9）		10		自然流速		/
	之后	洗脱液40 ℃下，氮气吹至近干
	其它	淋洗2完毕后，2.0 KPa以下减压抽干5 min
检测仪器	LC-MS/MS:赛默飞 TSQ Fortis
色谱条件	色谱柱		纳谱分析，ChromCore C18 2.1*100mm,3.0μm
	柱温		30 ℃
	流动相及梯度		A:0.1%甲酸水 B:甲醇
			时间（min）		A%		B%
			1.0		80		20
			4.8		5		95
			5.7		5		95
			6.0		80		20
	进样量		5 μL
	流速		0.35 ml/min
质谱条件	喷雾电压		3500 V(+)
	鞘气压力		30 Arb
	辅助气压力		4 Arb
	蒸发温度		300 ℃
	离子传输管温度		350 ℃

实验过程照片

图一：提取液待净化

图二：SPE小柱待活化

图三：SPE小柱洗脱

图四：0.1%甲酸水定容

图五：过膜

图六：上机分析

实验谱图

4种物质标准曲线图

Compound	RT	备注
四环素	2.98	同等浓度加标对比图中; 黑色---B净化柱；蓝色---纳谱；红色---A净化柱
土霉素	3.08
金霉素	2.72
强力霉素	4.17

空白基质TIC图

试剂空白TIC图

50 μg/kg-a

50 μg/kg-b

100 μg/kg-a

100 μg/kg-b

200 μg/kg-a

200 μg/kg-b

实验数据

SPE类型	化合物名称	加标浓度	平均回收率（%））	精密度（%）
纳谱	四环素	50 μg/kg	123	2.4
		100 μg/kg	116	4.6
		200 μg/kg	118	1.8
	土霉素	50 μg/kg	119	1.1
		100 μg/kg	115	6.3
		200 μg/kg	118	3.8
	金霉素	50 μg/kg	98.8	4.6
		100 μg/kg	98.0	5.6
		200 μg/kg	92.4	2.2
	强力霉素	50 μg/kg	88.7	3.8
		100 μg/kg	80.2	4.5
		200 μg/kg	104	0.46
B净化柱	四环素	50 μg/kg	80.2	8.2
		100 μg/kg	85.6	10
		200 μg/kg	86.4	5.2
	土霉素	50 μg/kg	76.3	9.5
		100 μg/kg	84.3	8.9
		200 μg/kg	98.6	8.6
	金霉素	50 μg/kg	70.2	10
		100 μg/kg	81.3	7.8
		200 μg/kg	74.6	7.9
	强力霉素	50 μg/kg	72.7	1.2
		100 μg/kg	80.6	4.1
		200 μg/kg	82.3	2.6
A净化柱	四环素	50 μg/kg	117	5.6
		100 μg/kg	97.2	5.8
		200 μg/kg	114	3.6
	土霉素	50 μg/kg	113	6.8
		100 μg/kg	103	5.2
		200 μg/kg	114	4.7
	金霉素	50 μg/kg	96.9	6.5
		100 μg/kg	94.5	6.3
		200 μg/kg	88.4	4.6
	强力霉素	50 μg/kg	88.8	4.2
		100 μg/kg	82.5	1.2
		200 μg/kg	103	2.3

结果分析

①SPE小柱流速对比：纳谱>B净化柱>A净化柱。

②纳谱回收率：80.2%-123%，平均值106%；精密度0.46%-6.3%，平均值3.4%；

B净化柱回收率：70.2%-98.6%，平均值81.1%；精密度1.2%-10%，平均值7%；

A净化柱回收率：82.5%-117%，平均值101%；精密度1.2%-6.8%，平均值4.7%；

讨论

实验选取猪肉作为样品基质，四环素、土霉素、金霉素与强力霉素作为目标化合物，以常用国标GB/T 21317为实验依据，分别添加检出限浓度、限值浓度、二倍限值浓度进行平行实验分析，通过实验数据可知：

B净化小柱整体回收偏低；对于四环素与土霉素两种化合物而言，纳谱与A净化柱回收整体偏高（大于100%），而金霉素与强力霉素两种化合物回收较好，整体回收率而言，纳谱略好于A净化柱。

就实验数据精密度而言，纳谱与A净化柱均小于5%。

结论

实验发现纳谱小柱回收率与精密度均很优秀，且小柱净化过程中的流速较快，节省时间。

最后，本文谨代表个人试验过程及体会，对于试验过程中的问题与不当之处，欢迎指出。

公司名称：山东华一检测有限公司

个人信息：郑××老师

地址：山东省高新区高新二路生物医药加速器4楼山东华一检测有限公司

色谱柱信息：

纳谱分析ChromCore C18 3μm, 2.1×100mm，序列号：21313-001034

纳谱分析SelectCore HLB 60mg/3ml