(14) 腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶:分别称取硫酸腺嘌呤,盐酸鸟嘌呤和尿嘧啶各0.2g,加入2.4 mol/L HCl溶液10 ml,加热溶解,用水稀释至100ml,室温贮存。
(15) 乙酸缓冲液(1.7mol/L,pH4.5):38.65g无水乙酸钠,19.8ml冰乙酸,加水稀释至500ml。
(16) 维生素溶液:取10mg核黄素溶解于40 ml乙酸缓冲液中。取0.2mg生物素,2.5mg NaHCO3,20mg对氨基苯甲酸,40mg盐酸吡多醇,4mg盐酸硫胺素,8mg泛酸钙,8mg尼克酸溶解于50ml水中。将上述两种溶液混合,加水至100ml。
(17) 吐温-80溶液:将2g吐温-80加入100ml 45℃水中,混匀。
(18) 还原型谷胱甘肽溶液:取0.1g还原型谷胱甘肽,加水至100ml.
(19) 甲盐溶液:称取5g磷酸氢二钾和2g磷酸二氢钾,加水溶解至100ml,液面上加入少许甲苯保存。
(20) 乙盐溶液:称取2 g硫酸镁,0.5 g硫酸亚铁和0.5 g硫酸锰,加水至100 ml,液面上加少许甲苯保存。
(21) 基础培养基:按下表配制,最终定容至500ml。
酶解酪蛋白
100ml
L-盐酸半胱氨酸
0.2 g
腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶
2.5 ml
色氨酸
0.2 g
黄嘌呤溶液
2.5 ml
还原型谷胱甘肽溶液
2.5ml
维生素溶液
5ml
葡萄糖
20 g
吐温-80溶液
2.5 ml
乙酸钠
20 g
L-天冬氨酸
0.3 g
甲盐溶液
2.5 ml
加水至250 ml,搅拌,用10mol/LnaOH溶液调节pH 6.8±0.1,然后加入乙盐溶液2.5 ml,磷酸缓冲液200 ml,用水补至500 ml。4℃冰箱内可保存一周 。
(甲、乙盐混合后易产生沉淀,所以配培养基时不可同时加入,加入甲盐后先调节pH再加入乙盐。基础培养基也可直接选购DIFCO公司生产的叶酸测定用培养基)
(22) 琼脂培养基:
葡萄糖
1 g
甲盐溶液
0.2 ml
蛋白胨
0.8 g
乙盐溶液
0.2 ml
酵母提取物干粉
0.2 g
琼脂
1.2g
乙酸钠(NaAc·3H2O)
1.7 g
加水至100 ml,置水浴煮至琼脂完全熔化,调节pH 6.8±0.1。尽快倒入试管中,每管3~5 ml,塞上棉塞,121℃高压灭菌15 min,取出后直立试管,冷却至室温.于冰箱内保存。
5.菌种制备与保存
(1) 储备菌种的制备:将L.C纯菌种转接至2个或多个琼脂培养基管中。37 ℃±0.5 ℃恒温培养箱中培养16~24 h。贮于冰箱内,每周转种一次留作储备菌种。
(2) 种子培养液的制备:取2 ml叶酸标准使用液和10 ml基础培养基,混匀,分装至4支5 ml离心管中,塞上棉塞,121℃高压灭菌15 min,实验时现制。
6.操作步骤
所有操作均需避光进行
6.1 样品制备
(1) 强化剂型样品:称取0.1~0.5 g样品(约含叶酸100~300 ng)于100 ml锥形瓶中,加入50 ml磷酸缓冲液,混匀。121℃高压水解15 min。定容至100ml,过滤。
(2) 果蔬类:称取样品0.2~2 g(约含叶酸100~300 ng),加磷酸缓冲液经高压水解后过滤,残渣用同样缓冲液再次高压,过滤。合并两次滤液,定容至100ml。
(3) 谷、肉、蛋、鱼、豆、奶类等富含淀粉和/或蛋白类样品:称取样品0.1-2 g(约含叶酸100~300 ng),加磷酸缓冲液高压水解后, 冷却。加入1 ml鸡胰酶和1 ml蛋白酶-淀粉酶液,1 ml甲苯,充分混合,置于37 ℃±0.5 ℃恒温箱内酶解16~20h。酶解后定容至100ml过滤。另取一支试管,加入1 ml鸡胰酶,1 ml蛋白酶-淀粉酶和磷酸缓冲液,作酶空白。
(4) 口服液、饮料、果汁等样品:称取样品0.5~2 ml(约含叶酸100~300 ng),加磷酸缓冲液高压水解后, 冷却,加入1ml鸡胰酶,1 ml甲苯,充分混合,置于37 ℃±0.5 ℃恒温箱内酶解16~20 h。酶解后定容至100ml,过滤。另取一支试管,加入1 ml鸡胰酶和磷酸缓冲液,作酶空白。
6.2根据样品叶酸含量,将上述滤液用磷酸缓冲液稀释到一定倍数,使叶酸终浓度为0.1~0.4 ng/ml。
6.3样品管的制备:取4支试管,每支试管中分别加入稀释后样品液1.0、2.0、3.0、4.0 ml,补充水至体积为5.0 ml,加入5 ml基础培养基,混匀。同样制作酶空白管。
6.4 灭菌:将以上标准系列管、样品管和酶空白管全部塞上棉塞,121℃高压灭菌15 min。