主题：【分享】什么是高速逆流色谱

高速逆流色谱在植物有效成分分离中的应用
1 生物碱
　生物碱是植物中一类重要的化学成分，在植物中分布非常广泛，至少有50多科120属以上的植物中已证明有生物碱存在，已知的生物碱种类也至少在2000种以上。到目前为止，用高速逆流色谱研究天然产物化学成分也以生物碱的研究报道得最多。
正丁醇—丙酮—水(8∶1∶10)曾用于从委内瑞拉的箭毒中分离马枯素和Panarine，样品进样达700mg；正丁醇—氯化钠(0.1mol/L)(1∶1)的两相溶剂体系用于从Strychnos usambarensis(马钱科)的树干和树皮中分离10-羟基-Nb-甲基-柯楠醇；用正己烷—乙酸乙脂—甲醇—水(3∶7∶5∶5)在70min内以1800r/min的转速从粉防已干根的提取物中分离了粉防己碱、去甲粉防己碱和轮环藤酚碱；从小蔓长春花植物的叶子中用正己烷—乙醇—水(6∶5∶5)体系分离长春胺和长春辛；分别用正己烷—乙酸乙脂—乙醇—水(6∶3∶2∶5)和正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水(1∶1∶1∶1)从红豆杉的粗提物中分离纯化了紫杉醇、cephalomannine、巴卡亭Ⅲ；以石油醚(bp.40～65℃)—乙酸乙脂—甲醇—水(50∶70∶80∶65)为两相体系从紫杉醇的混合物中分离得到了纯的紫杉醇和cephalomannine。
有学者对粉防己的粗提物也进行了分离；从苦参总碱中分离了苦参碱和氧化苦参碱，从洋金花总碱中分离了莨菪碱、东莨菪碱及待定成分；从峨眉千里光粗碱中分离了金缘千里光碱、阔叶千里光碱和新阔叶千里光碱；从三尖杉总碱中分离异三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱和三尖杉酯碱。
氯仿—甲醇—水(5∶4∶3)体系曾用于感染了枝顶孢属内部寄生菌的睡眠草，分离得到了麦角生物碱。Ito于1994年用新型的pH区带提取CCC技术从Crinum moores的抽取物中进样3g得到了3个纯的生物碱，此技术是HSCCC的一个较大的突破，它使植物的分离提取每次很方便地就达到了克量级。
2 黄酮类似物
黄酮类似物是一类比较重要的植物化学成分，它包括黄酮、异黄酮、二氢黄酮、花色苷元、儿茶精和属于黄酮异构体的橙酮，以及由它们所衍生的各式各样的衍生物。
用氯仿—甲醇—水(4∶3∶2)体系曾从芫花总黄酮中一次进样100mg分离得到了3'-羟基芫花素、洋芹素、木犀草素；从山楂叶粗提物中分离金丝桃苷、槲皮素、芦丁、牡荆素、异牡荆素；以氯仿—甲醇—水(33∶40∶27)体系，700r/min转速，在70min内从黄酮混合物中分离出橙皮素，四羟基黄酮和槲皮黄酮，并有效地利用了梯度洗脱技术；Vanhaelen等将HSCCC与HPLC相结合从500mg的Ginkgo biloba(银杏属)的叶子萃取物中一次分离出了7个黄酮苷，其以水为固定相，开始以乙酸乙酯为流动相，然后在流动相中逐渐添加异丁醇，到分离结束时乙酸乙酯与异丁醇之比为(6∶4)；Oka等以氯仿—甲醇—水(4∶3∶2)的体系在3500r/min在8min内从See buckthourn的果实萃取物中分离得到了5个主成分，其分离速度完全可与HPLC相比较；还有学者也从大黄羟基蒽醌总苷元中分离了大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚等；用正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水(9∶1∶5∶5)在1800r/min转速下在70min内从掌叶大黄的根茎中分离出大黄素甲醚、芦荟大黄酸、大黄酸、大黄酚和大黄素；将Epilobium parviflorum(柳叶菜属)的甲醇萃取物进样2g分离得到了槲皮苷、杨梅苷、异杨梅苷和没食子酸，两相系统为氯仿—甲醇—水(7∶13∶8)。
Chen1992年利用氯仿—甲醇—水(4∶3∶2)的两相系统对5个黄酮类化合物进行了分离并进行了定量分析；Kapadia 1994年利用正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水(1∶4∶2.5∶2.5)从Garcinia Kola(藤黄属)种子中也分离出了多个双黄酮。
3 萜类
萜类是具有(C5H8)n通式的天然化合物，以及含氧及饱和程度不等的衍生物。Wallach曾提出异戊二烯法则，根据分子中可分异戊二烯的多少分别称为单萜、倍半萜、二萜、三萜等，植物中存在的橡胶、某些色素、挥发油、树脂、苦味素等类型成分，大多属于萜类或含有萜类成分。
有人从青蒿中纯化出了Artemisinin，实验以异辛烷—乙酸乙酯(7∶3)为固定相，甲醇—水(6∶4)作为流动相；以异辛烷—甲醇—水(10∶7∶3)为固定相和流动相从青蒿中分离了epideoxyarteannuin；利用四氯化碳—甲醇—水(5∶4∶1)的溶剂系统以800r/min的转速，将Cochlospermum tinctorium(卷胚属)的根的甲醇萃取物500mg溶解在10ml的1∶1的两相溶剂系统中一次进样得到纯的
cochloxan-thin和dihydrocochloxanthin；以氯仿—甲醇—水(9∶12∶8)从龙胆的根的甲醇萃取物中分离得到了1个裂环烯醚萜苷，从Halenia campanulata中分离得到了2个裂环烯醚萜苷类；以氯仿—甲醇—水(7∶13∶8)从Abrus fruticulosus的叶中分离出了4个甜味三萜苷；从非洲植物Sesamum alatum中分离出了18,19-secoursane clisaccharide，两相系统为氯仿—甲醇—戊醇-2—水(5∶6∶1∶4)；用氯仿—甲醇—异丁醇—水(7∶6∶3∶1)的系统从积雪草的抽提物中分离了2个结构非常相似的皂角苷，1个是积雪草苷、1个是
madecassoside，它们仅在同一支链上前者是H，后者是OH。
4 木脂素
木脂素是一类由被子植物和裸子植物中分离出的植物成分，隐花植物中很少存在，它一般在木部和树脂中存在得比较广泛，所以称为木脂素类。Marrston等1988年以1g的进样较大范围地分离制备了肉桂酸、阿魏酸和咖啡酸，采用的溶剂系统为正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水(3∶7∶5∶5)，转速700r/min。
以正己烷—甲醇—水(6∶5∶5)的两相系统以1500r/min的转速在80min内曾从江花五味子果实的核的乙醇萃取物中分离了2个结构十分相似的木脂素的成分—schisanhend和它的乙酸化物；以氯仿—甲醇—水的溶剂系统从西伯利亚人参的根中分离得到了纯的eleutheroside。
Nitao等于1991年主张用正己烷—乙腈—乙酸乙酯—水(8∶7∶5∶1)的两相系统从Magnolia virginian中进行neelignans的最初纯化，它比传统的柱色谱更快、更有效、更经济。

5 香豆素类
香豆素及其衍生物广泛分布于植物界。曾用氯仿—甲醇—水(13∶23∶16)的两相系统一次进样440mg来自于Lomatium dissectum的样品得到了3个香豆素的苷和1个黄酮苷；用氯仿—甲醇—水(13∶7∶8)的两相体系分离并分析了香豆素混合物中甲醚散形酮、7-甲氧(基)香豆素、7-羟基-6-甲氧基香豆素和7-羟基香豆素；俞维乐等1995年从Artemisia dalailamae kraschen中以氯仿—甲醇—水(2∶1∶1)分离出了纯的7-羟基-6-甲氧基香豆素以及isofraxdin和taxaxeryl-acetate，达到了很好的分离效果。

高速逆流色谱的一些新进展
1 与其他检测器的联用
目前HSCCC多采用紫外检测器进行在线检测，但HSCCC选用的有机溶剂及所分离的组分，有很多不适合用紫外检测，因而大家把目光投向了各种检测器与HSCCC联用技术上来。分流器技术的使用，解决了HSCCC与各种检测器联用的接口问题，目前已有HSCCC与质谱（MS）、红外（FTIR）、蒸发光散射（ELSD）联用的应用，从而为HSCCC的应用提供了一种新型***分离分析方法。Rinehart等报道了HSCCC与电喷雾质谱（ESIMS）联用技术，并评价了色谱分离和质谱分析的表现，认为制备型逆流色谱更适合于天然产物的分离分析。
近两年，国外有人成功的将HSCCC与ELSD联用，分离了7-甲氧基香豆素、橙皮素、莨菪亭、微形酮，效果非常好。总之，各种检测器的优点与HSCCC技术的良好地结合，为逆流色谱技术的应用开创了一个广阔的局面。
2 双向逆流色谱
双向逆流色谱（dual-mode countercurrent chromatography,简称DuCCC），即两相分别从螺旋管两端同时流入，又从相对应的端口同时流出，两相形成真正的逆向对流。与常规的HSCCC相比，DuCCC分离速度更快，分离效率更高，不必预测溶质的保留时间和分配系数，减少了溶剂选择的繁琐。该项技术可应用在蛋白分离。
3 利用HSCCC建立中药指纹图谱
中药质量可控是中药现代化的一个重要内容，中药以及复方因其复杂的成分和未明的作用机理，阻碍着中药现代化的进程。中药指纹图谱技术已成为研究中药有效成分及作用机理，控制中药质量，推动中药业走向世界的关键技术。HSCCC具有很好的分辨率和重现性，加上不存在固体载体吸咐，对样品的前处理要求不高或不用前处理，不存在分离过程丢失成分和成分变性的问题，因而可用于中药有效成分的定性或半定量分析，并整理出中药材的特征峰和指纹谱，制定标准图谱，用于中药的质量控制和测定。在高速逆流色谱指纹图谱研究方面，目前已对大黄、沙棘、何首乌等一些中药进行了研究。
对于高速逆流色谱,由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段。
关键点就在于溶剂系统的选择。
你好，根据我做高速逆流色谱的经验，采用正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水的体系，如果你降低正己烷的量，保留不会有所提高，可能发而会降低。固定相的保留率根上下两相的比重差有很大的关系，如果比重相差越大，上下相分相就会越快，保留一般就会很高，如果你降低正己烷的量的话，保留就会变得更差，分离效果也会变得更差。如果想增加保留而且分离效果变好的话，我想你应该根据你样品在上下相中的溶解度大小来做一个判断，如果样品在上相溶解的多，但是保留差，那你应该降低水的量，来增加下相的有机性，调整分配比。如果你样品在下相溶解的多，可以适当增加甲醇的量。我觉得中等极性的化合物正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水 还有氯仿：甲醇：水体系都能进行分离。
第二个问题，理论上K值得范围应该在0.6-1.5，但是根据实验，在0.3-2左右也是可以允许的，还有你用的是粗提物，不知道目标样品的含量如何？如果含量大于3%应该比较好分。

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