主题：【转帖】蛋白质的分离纯化

原文由 hmzhou83 发表:
蛋白质分离纯化鉴定

包括蛋白质样品的基本处理注意事项，蛋白质分离纯化方法的基本原理和选择，纯化后蛋白质浓度及蛋白质基本性质的研究方法。

  http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20081009/1522386/

还可以发一个LC用于蛋白质和生物大分子的研究原理和概述。这个我还是空白。

常用的液相色谱纯化方法及其原理

方法                  分离原理                基于
凝胶过滤（GF）        分子大小/形状        分子形态

离子交换色谱（IEX）  分子所带电荷    Asp、Glu、Lys、Arg His
                                            等带电氨基酸

疏水作用色谱（HIC）    表面疏水性          Trp、Phe、Ile、Leu、Tyr、
                                    Pro、Met、Val、Ala等疏水性氨基酸

反相色谱（RPC）        表面疏水性      Trp、Phe、Ile、Leu、Tyr、
                                    Pro、Met、Val、Ala等疏水性氨基酸

金属螯合色谱（IMAC）  分子与金属形成配位键      His、Trp、Cys

亲和色谱                特异生物识别作用    抗原-抗体，酶-底物，
                                              酶-抑制剂等
共价结合色谱                共价结合        巯基（Cys）

目前常用液相色谱纯化方法

1、凝胶过滤（gel filtration，molecular sieve chromatography 分子筛、size exclusion chromatography 大小排阻色谱，gel permeation chromatography 凝胶渗入色谱）。
    根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量（Stroke半径）较大的先出峰，分子量小的后出峰。最常用的经典凝胶为Sephadex G系列，此外还有Sephacryl、Sepharose、Superose、Superdex等凝胶系列。凝胶过滤法方法简单、重现性强，目前广泛应用。
    凝胶过滤具有很多不同分离范围的凝胶系列供选择。
    要点: 采用细长（L/D~20）的柱、选择合适的凝胶、上样体积较小、流速较慢。

常用凝胶过滤用凝胶及其基本参数
系列 名称 分离范围 颗粒大小 应用
Superdex prep grade系列 Superdex 30PG 小于10000 24~44微米 小肽
Superdex 75PG 3000~70000 24~44微米 一般蛋白
Superdex 200PG 10000~600000 24~44微米 单抗、大分子蛋白
Superose系列 Superose 6 PG 5000~5000000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸、病毒
Superose 12 PG 1000~300000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸
Sephacryl HR系列 Sephacryl S-100 1000~10000 25-75微米 肽类、小蛋白
Sephacryl S-200 5000~250000 25-75微米 一般蛋白
Sephacryl S-300 10000~1500000 25-75微米 抗体等较大蛋白
Sephacryl S-400 ~28000000 25-75微米 多糖、蛋白多糖、脂质体
Sephacryl S-500 ~60000000 25-75微米 <1078bp的DNA片断
Sephacryl S-1000 ~100000000 40-105微米 <20000bp的质粒、巨大多糖、病毒
Sepharose FF系列 Sepharose 6 FF 10000~4000000 45~165微米 质粒、病毒
Sepharose 4 FF 60000~20000000 45~165微米 病毒，rHBsAg等巨大分子
Sepharose xB（CL-xB）系列 Sepharose 2B 70000~40000000 60-200微米 大分子复合物
Sepharose 4B 60000~20000000 45-165微米 病毒等大分子
Sepharose 6B 10000~4000000 45-165微米 大分子
Sephadex LH系列 Sephadex LH20 100-4000 30-100微米 天然产物
Sephadex LH60 400-20000 40-120微米 天然产物
Sephadex系列 Sephadex G-10 小于700 40-120
Sephadex G-15 小于1500 40-120
Sephadex G-25
coarse 1000-5000 100-300 脱盐及更换缓冲液用
Sephadex G-25
medium 1000-5000 50-150
Sephadex G-25
fine 1000-5000 20-80
Sephadex G-25
superfine 1000-5000 10-40
Sephadex G-50
coarse 1500-30000 100-300 小蛋白、多肽的分离
Sephadex G-50
medium 1500-30000 50-150
Sephadex G-50
fine 1500-30000 20-80
Sephadex G-50
superfine 1500-30000 10-40
Sephadex G-75 3000-80000 40-120 一般蛋白的分离
Sephadex G-75
superfine 3000-70000 10-40
Sephadex G-100 4000-150000 40-120 较大蛋白的分离
Sephadex G-100
superfine 4000-100000 10-40
Sephadex G-150 5000-300000 40-120 大蛋白的分离
Sephadex G-150
superfine 5000-150000 10-40
Sephadex G-200 5000-600000 40-120 大蛋白的分离
Sephadex G-200
superfine 5000-250000 10-40

2、离子交换色谱（ion exchange chromatography）
    蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于其等电点时，带净负电荷。阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱
    对于等电点小于5.0的酸性蛋白质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于7.0的碱性蛋白质，推荐使用阳离子交换。
    两种模式：一种使目的蛋白结合凝胶，通过梯度洗脱；一种使目的蛋白不结合凝胶，而大部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有目的蛋白。

3、疏水作用色谱
    利用蛋白质、多肽在高盐存在下，可以结合疏水凝胶，而在盐浓度降低时又可以解脱的原理实现分离。


疏水作用分离生物活性蛋白

4、亲和色谱
    利用蛋白质、多肽与某些配基的特异性相互作用而进行分离。例如：酶-底物，酶-抑制剂，糖蛋白-凝集素，抗原-抗体等。近来发展了金属螯合亲和色谱，用于纯化表面含色氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋白质以及(His)6-tagged重组蛋白。
    亲和色谱分为特异性亲和色谱和组别亲和色谱两类。肝素、凝集素、染料、金属螯合亲和色谱均为组别亲和色谱（同一配基可以结合许多种蛋白质）。


5、反相色谱
    常用于蛋白质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极高，可以分离两种仅相差一个氨基酸的多肽。如血管紧张素（angiotensin）的几个亚型通过反相色谱可以很好地分离。
    同一个样品在同一Source 30 RPC柱上进行分离，由于色谱条件进行了改变，色谱图截然不同，说明反相色谱具有高度的选择性。