呵呵,上次发了EP6.0有好多老师帮我指出了问题,所以这次又把自己弄得微生物部分放上来,希望大家多多指教啊。呵呵
2.6.1未灭菌产品的微生物检测:总的可生长生物菌数
这个总章有两套测试方法。第一套方法给出了测定是否符合各论的参考方法。除非其中指定了使用第二套检测方法,专论中的这个章节的参考标准表示符合第一套检测方法。第二套的检测方法也组成欧洲药典的官方检测方法,或者提到类似的说明,特别是在市场营销授权中。现在打算用方法二代替方法一,一旦有关的专论被修改。介绍的第二套检测方法与日本药典和美国药典合作获得一致的要求。
A.欧洲药典的方法
以下所要描述的试验可定量检测出有氧条件下嗜温性细菌及菌类的数目。
这个试验首先旨在于确定专题论文中的物质是否符合药典中关于微生物的要求。当用于此目的时可参考下面的说明,包括取样的数目及以结果的解释如下。这个测试还可用作药典中保存的抗菌剂功效(5.1.3)试验。他们可以用于进一步监测原料质量和用于连同指导的微生物质量(5.1.4)的相关项目。当用于这些目的时,例如制造者用于监测原料或成品或工艺验证,测试的产品包括取样的数目,结果的解释等都需要制造者与有能力的权威机构达成共识。
在避免产品额外污染的条件下进行检测。避免污染进行的预防措施不能影响到试验中显示出的微生物。如果要检测的产品有抗菌活动性必须将其充分消除。如果灭活剂用于此目的,他们对微生物的的功效及无毒性就会显现出来。
通过药典中所描述的膜过滤方法确定活菌总数目,或用平板计数法。
当没有其它方法可用于计算细菌数目时,最可能数量法被保留。方法的选择基于几个因素,例如产品的性质,微生物的期待值。选择任何方法都要经过适当的验证。
当联合使用5.1.3和5.1.4时,平板计数法,表面铺展法和膜过滤法可能用到。
样品的制备
取样方案 产品取样必须依照一个较好定义的取样方案。取样方案主要取决于例如批量,不可接受的高污染产品的健康危害,产品的物性及污染的预期水平等因素。除非另有指定,取10g或10ml物质或者制剂样品进行试验,采取上文提到的预防措施。从散料中或者制剂可用的容器中随机的选择样本。如果必要的话,混合足够数量的容器中的内容物来提供每个样品,以取得所需的数量,取决于待检测物质或者制剂的性质。一个抽样方案适合于微生物在产品中分布均匀的状况,一般认为可分为以下三类:
1. 可接受样品,例如,样品每克或每毫升包含少于m集落形成单位,m表示相关专著中规定的限度。
2. 边际样品,例如每克或者每毫升中多于m菌落形成单位,但少于10m菌落形成单位3. 缺陷试样,例如每克或者每毫升中包含多于10m菌落形成单位。
水溶性产品 在pH=7.0缓冲氯化钠蛋白胨溶液或其它恰当的液体中溶解或稀释10g或10ml产品.一般来说一个样品稀释十倍制备,尽管如此,由于产品的特性或对灵敏度的要求可以制成其它的比例。如果已知此产品有抗微生物活性,可加灭活剂到稀释液中。如果需要,调节pH=7值,用相同的稀释剂制备进一步的一系列的10倍稀释液。
不溶于水的非脂肪产品.在pH=7.0缓冲氯化钠蛋白胨溶液或其它恰当液体中溶解10g或10ml产品。一般一份样品制备成10倍的悬浮液,但由于某些产品的特性可能有必要增大使用的体积。一种恰当的表面活性剂,例如可加入1g/l聚山梨酯80至可湿性较差的悬浮液中。如果已知产品有抗微生物活性,可加入灭活剂到稀释液中。如果需要,调节pH约等于7,可进一步用同一溶剂制备一系列的10倍稀释液。
脂肪产品.混合10g或10ml的待测样品与不超过其重量一半的已消毒的聚山梨酯80或其它的恰当的表面活性剂,调匀,如果必要的话加热至不超过40℃,如果特例的话不超过45℃。小心混合,如果有必要可在水浴或者恒温箱中保温。加入充分预热的pH=7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液制备制备原始产品的10倍稀释液。小心混合,保持乳状物形成所需的最短时间内的温度,在任何情况下都不要超过30分钟,进一步用pH=7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液,适当浓度已消毒的聚山梨酯80或其它浓度的表面活性剂进一步制备10倍稀释液 。
贴剂.用消毒的产钳去掉十个制备好的透皮贴剂的防护膜(露出衬垫),有粘性的一面往上,放到已消毒的玻璃或塑料盘上。用消毒的纱布盖住粘性面(或无纺布过滤器型单丝聚合物网),如果必要的话将这十个贴片转移到含有适宜的灭活剂例如聚山梨酯80或蛋黄素,最小体积500mlpH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液中。用力振荡此制备品至少三十分钟(制剂A)以相同方式制备另外十个贴片,将其放在500ml肉汤介质D中,并用力振荡制剂至少三十分钟(制剂B)
产品的检测
薄膜过滤.用名义孔径不超过0.45um且已建立有效保持细菌的薄膜过滤。过滤材料的选择以薄膜对细菌保持的有效性不受检测样品成分的影响。硝酸纤维素过滤膜,例如,可用于水性,油性,弱酒精性溶液 醋酸纤维素膜例如可用于强酒精性溶液。过滤装置的设计允许将过滤转移至培养介质中。
取按照样品制备部分描述的方法制备的样品适量(最好一种产品取1g,如果集落形成单位要求较大的话也可少取些)每个用两层膜迅速过滤。用三倍量,每次大概100ml的适当液液体例如pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗过滤器,可向溶液中加入表面活性剂如聚山梨酯80或抗微生物的灭活剂。如果得到验证,冲洗次数可以少于3次。转移一层过滤膜,首先对细菌计数,在表面上放一层适当的琼脂,例如介质B或其它,如果为了真菌计数在表面上也放一层适当的琼脂例如介质C, 在30-35℃孵化琼脂B的培养基,琼脂C的培养基在20-25℃,五天,除非在短时间内就可得到可靠数量。选择最大数目少于100集落的平板,并且计算每克或每毫升产品的集落数。
当检测贴剂时,分别用两个无菌滤膜过滤每分50ml制备品A。一个膜放上琼脂B用来测总存活数,另一个用琼脂C测真菌数。
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