2、样品最大有效稀释倍数或最小有效浓度的计算
最大有效稀释倍数(MVD)是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下,对产品进行最大倍数的稀释,仍能够进行内毒素限值的检测,此时所允许稀释的最大倍数。 MVD的计算公式为:当被规定的内毒素的限值以体积表示时, MVD=内毒素限值L(EU/ml )/鲎试剂灵敏度(λ);当内毒素的限值以重量或药品的生物活性(EU/mg或EU/u)表示时, MVD=内毒素限值L(EU/mg 或 EU/u)×供试品溶液的浓度C/ 鲎试剂灵敏度(λ)。在凝胶法中, λ=鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml),在浊度法或显色法中, λ=所使用标准曲线上最低点的内毒素浓度(EU/ml)。
最小有效浓度(MVC)是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下,将产品稀释到一定浓度,仍能够进行内毒素限值的检测,此时所允许的最小浓度。计算MVC的一般公式为:MVC=鲎试剂灵敏度(λ)/内毒素限值(L)。对所选定的鲎试剂灵敏度来讲,MVC是一个绝对值;而MVD对特定的产品浓度是特异的,浓度变化时,MVD也会随之发生变化。
3、方法学验证试验的预试验
确定了样品的内毒素限值,考察了样品的溶解性,并且选定了一定灵敏度的鲎试剂,此时便可以考虑进行预试验。尽管法规中并不要求进行预试验,但在细菌内毒素检查法的建立过程中,一般需要进行预试验。预试验的主要目的是确定不出现干扰的第一个样品稀释度,也就是不干扰浓度(non-interfering concentration, NIC),为后续的验证试验选择适当的样品稀释度(或浓度)。
不管采用凝胶法还是光度法,预试验都是对一系列样品的稀释液进行试验,在每一个稀释浓度,都有一组添加内毒素的样品和一组不添加内毒素的样品,添加内毒素的浓度保持不变,而样品浓度会逐级稀释,但最终样品的稀释倍数不得超过MVD。可以采用直接把内毒素添加到样品溶液中,添加内毒素的体积宜小,以免导致样品溶液被稀释,一般添加体积等于或小于样品体积的10%为宜;也可以采用下述方法添加内毒素,就是将两倍于终浓度的内毒素溶液与两倍于终浓度的样品溶液等体积混合,内毒素和样品溶液间相互稀释,得到两者所需终浓度的混合液。添加内毒素的浓度,凝胶法为2λ;终点显色法为4λ(这里的λ表示标准曲线上的最低点,也就是方法的检测限)。动态显色法则有3种选择添加内毒素浓度的方法,可以选择标准曲线的中点浓度,也可以与终点比色法一样,选择4λ。此外,当样品稀释液中,内毒素的限值小于或等于1.0EU/ml时,添加内毒素的浓度可定为0.1-0.5EU/ml之间,当样品稀释液中,内毒素的限值大于或等于1.0EU/ml时,添加内毒素的浓度可定为1.0-5.0EU/ml之间。
对于凝胶法的结果判断,不添加内毒素的样品不应该凝集,如果发生凝集说明含有内毒素或内毒素样物质;添加有内毒素的样品应该出现凝集,若没有发生凝集表明样品凝集反应被抑制。光度法的结果判断标准为,测得的添加内毒素的量应该在已知添加量的±50%范围内,超出范围(多或少)表明存在增强或抑制作用。
通过预试验结果可以确定验证试验中样品的稀释度或浓度,其选择的基本原则包括:经稀释后的样品含内毒素的量应尽可能少,比其内毒素限值至少少4倍,最好检测不到内毒素。要求验证试验选择的稀释度至少要比NIC大1-2倍,但不可超过MVD。若样品需要多支合并进行验证试验,此时试验不可采用原来的MVD,因为假定合并样品中有一瓶存在污染,其它瓶没有污染,污染瓶含有的内毒素就会被其它没有污染瓶样品所稀释,并低于MVD,从而检测不到污染的样品。因此,采用合并样品进行试验时,MVD应降低,这种情况下的MVD等于原来的MVD除以合并样品的数量。
例如:假定鲎试剂的标示灵敏度λ为0.125EU/ml,样品的MVD为100(倍)。