幽门螺旋杆菌感染的检查方法很多,主要包括细菌的直接检查、尿毒酶活性测定、免疫学检测及聚合酶链反应等方法。
(1) 细菌的直接检查
是指通过胃镜检查钳取胃粘膜(多为胃窦粘膜)作直接涂片、染色,组织切片染色及细菌培养来检测幽门螺旋杆菌。其中胃粘膜细菌培养是诊断幽门螺旋杆菌最可靠的方法,可作为验证其他诊断性试验的“金标准”,同时又能进行药敏试验,指导临床选用药物。
(2) 尿毒酶检查
因为幽门螺旋杆菌是人胃内唯一能够产生大量尿毒酶的细菌,故可通过检测尿毒酶来诊断幽门螺旋杆菌感染。尿毒酶分解胃内尿毒生成氨和二氧化碳,使尿素浓度降低、氨浓度升高。基于此原理已发展了多种检测方法:①胃活检组织尿毒酶试验;②呼吸试验;③胃液尿素或尿素氮测定;④15N-尿素试验。
(3) 免疫学检测
目前已有多种免疫学检测方法,通过测定血清中的幽门螺旋杆菌抗体来检测幽门螺旋杆菌感染,包括补体结合试验、凝集试验、被动血凝测定、免疫印迹技术和酶联合吸附测定(ELISA)等。
(4) 聚合酶链反应技术
正常胃粘膜很少检出幽门螺旋杆菌(0~6%),慢性胃炎患者幽门螺旋杆菌的检出率很高,约50%~80%,慢性活动性胃炎患者幽门螺旋杆菌检出率则更高,达90%以上。
(5) C-14呼气检测仪+呼气检测口袋
只需要吹气5分钟外,无其他任何不适。 该方法使众多高血压、心脏病及对胃镜过敏的患者避免了做胃镜的不适感,是目前理想的检测方法之一。是目前检测HP的医学界的金标准.敏感性95%,特异性 95%~100%。
幽门螺杆菌,Helicobacter pylori,简称Hp。首先由巴里·马歇尔(Barry J. Marshall)和罗宾·沃伦(J. Robin Warren)二人发现,此二人因此获得2005年的诺贝尔生理学或医学奖。
形态学特征
幽门螺杆菌是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌。长2.5~4.0μm,宽0.5~1.0μm。革兰染色阴性。有动力。在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。在固体培养基上生长时,除典型的形态外,有时可出现杆状或圆球状。
电子显微镜下,菌体的一端可伸出2~6条带鞘的鞭毛。在分裂时,两端均可见鞭毛。鞭毛长约为菌体1~1.5倍。粗约为30nm。鞭毛的顶端有时可见一球状物,实为鞘的延伸物。每一鞭毛根部均可见一个圆球状根基伸入菌体顶端细胞壁内侧。在其内侧尚有一电子密度降低区域。鞭毛在运动中起推进器作用,在定居过程中起抛锚作用。
生理学和分子生物学特征
幽门螺杆菌是微需氧菌,环境氧要求5~8%,在大气或绝对厌氧环境下不能生长。许多固体培养基可作幽门螺杆菌分离培养的基础培养基,布氏琼脂使用较多,但需加用适量全血或胎牛血清作为补充物方能生长。常以万古霉素、TMP、两性霉素B等组成抑菌剂防止杂菌生长。
幽门螺杆菌对临床微生物实验中常用于鉴定肠道细菌的大多数经典生化实验不起反应。而氧化酶、触酶、尿素酶、碱性磷酸酶、r-谷氨酰转肽酶、亮氨酸肽酶这七种酶反应是作为幽门螺杆菌生化鉴定的依据。
幽门螺杆菌的全基因序列已经测出,其中尿素酶基因有四个开放性读框,分别是UreA、 UreB、 UreC和UreD。UreA和UreB编码的多肽与尿素酶结构的两个亚单位结构相当。幽门螺杆菌的尿素酶极为丰富,约含菌体蛋白的15%,活性相当于变形杆菌的400倍。尿素酶催化尿素水解形成氨云保护细菌在高酸环境下生存。此外,尚有VacA基因和CagA基因,分别编码空泡毒素和细胞毒素相关蛋白。
根据这两种基因的表达情况,又将幽门螺杆菌菌株分成两种主要类型:Ⅰ型含有CagA和VacA基因并表达两种蛋白,Ⅱ型不含CagA基因,不表达两种蛋白,尚有一些为中间表达型,即表达其中一种毒力因子。现在多认为Ⅰ型与胃疾病关系较为密切。
培养
用于培养的胃粘膜活检标本应置于生理盐水、营养肉汤或20%葡萄糖中,然后立即转送到细菌室培养。如果标本不能在4个小时内培养,就应放在4摄氏度保存,但不宜超过24小时。长期保存用于培养的活检标本的唯一方法是将其置于-70摄氏度或液氮之中。
培养幽门螺杆菌的培养基包括非选择性及选择性两种。常用的非选择性培养基基础为脑心浸液琼脂、哥伦比亚琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂以及Wilkins-Chalgren琼脂。培养基中需加7%-10%的去纤维蛋白马血。羊血、人血、马血清、氯化血红素、淀粉、胆固醇或环糊精(cyclodextrins) 也可代替马血。选择培养基则是在上述培养基中添加一定的抗菌药物,如万古霉素、啶酸、二性霉素B、多粘菌素B以及甲氧苄氨嘧啶(TMP)。
常用的有Skirrow 配方及Dent配方。前者原用于弯曲菌的培养,亦可用于幽门螺杆菌培养。后者为前者的改良,即将多粘菌素用头孢磺啶取代,因为少数(5%左右)幽门螺杆菌菌株对多粘菌素敏感。Drnt配方为万古霉素(10mg/L)、头孢磺啶(5mg/L)、TMP(5mg/L)以及二性霉素B(5mg/L)。有报道指出,部分菌株对啶酸敏感,因而培养基中应尽量避免作用该抗生素。
菌种 | 触酶 | 硝酸盐还原 | 碱性磷酸酶 | 脲酶 | 醋酸吲哚酚水解 |
幽门螺杆菌 | + | + | + | + | - |
毕氏螺杆菌 | + | + | + | + | + |
犬螺杆菌 | - | - | + | - | + |
同性恋螺杆菌 | + | + | - | - | - |
菲氏螺杆菌 | + | - | + | - | + |
幼禽螺杆菌 | + | + | - | - | - |
H.westmeadii | + | + | + | - | ND |
【关键词】 Hp;14C呼吸试验;血清学试验
Hp感染是一个世界性问题,而我国属于感染率较高的国家,幽门杆菌在慢性胃炎和消化性溃疡等疾病中较为常见[1]。对正常健康人群进行快捷准确的方法,有利于流行病学调查和基层医院的使用。
1 材料与方法
1.1 标本来源
637例25~80岁的疗养体检人员,其中男508例,女129例,全部被检者均未经过Hp治疗。
1.2 方法
1.2.1 14C呼吸试验
受检者在检查前禁食4~6h。受试前漱口。用120ml温水送服4++明胶胶囊1粒(由上海欣科医药有限公司提供),内含尿素[14C]37kBq,静坐10~20min,患者深呼吸屏住2~3s,嘱受试者通过呼吸管向集气闪烁瓶吹气,吹气后在集气闪烁瓶中加入一定量闪烁液,用液体闪烁仪测定集气瓶中14C的CPM(DPM)的量,样品的放射活度与本底值的比≥3.0倍(或集气瓶中净DPM≥200)即为阳性。
1.2.2 血清学试验
每例病人采血1ml,分离血清,采用DIGFA检测病人血清中的抗Hp-IgG。试剂盒由浙江省医学科学院提供,其中抗原为Hp混合型纯化尿素酶抗原;载体是硝酸纤维素膜;检测探针为胶体金标记兔抗人IgG;按说明书操作;判断结果根据硝酸纤维素膜出现红色为阳性,仅留白色背景为阴性;质控对照采用Hp标准阳性、阴性血清[2]。
1.3 统计学方法 χ2检验。
2 结果
637例体检人员同时用14C呼吸试验和血清学检测,其中14C呼吸试验189例阳性,阳性率29.6%(189/637),血清学试验179例阳性,阳性率28.1%(179/637)。两种检测方法总阳性率33.7%(215/637)。如用血清学试验漏检率5.6%(36/637),14C呼吸试验漏检率4%,两种方法经统计学处理差异无显著性P>0.05,χ2=1.30,结果见表1。表1 血清学和14C呼吸试验比较(略)
3 讨论
Hp是一种G-弧形和S形弯曲菌,特异地寄生于胃黏膜黏液层下面,上皮细胞表面,它与慢性胃炎、消化性溃疡有密切关系,也是胃癌发病的危险因素[3],通过对疗养体检者的人群检测Hp,一方面可筛查Hp阳性率在人群中的比率,另一方面也可给临床提供相关疾病的诊断依据。根据上述不同方法检测Hp,得出14C呼吸试验和血清学试验两种方法差异无显著性,14C呼吸试验因有一定的放射性,还要有特殊的仪器使其应用范围有限,而血清学方法简便、非创伤性、无污染等特点,有利于基层广泛的开展和进行血清流行病学调查。