主题:【第六届原创】液相色谱柱表面碳含量和极性对分离的影响

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yigaozizi
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色谱柱表面碳含量和极性对分离的影响



背景

    反相色谱柱如C18是色谱分析工作者在实验中经常使用的工具,但是不同种类的C18色谱柱往往表现不一样。

    本研究的目的是从C18色谱柱的表面性质去揭示影响分离效果的因素。主要考虑的表面性质有碳含量和表面极性(硅羟基数)。

实验原理

通过对阿巴斯甜标准品和酸奶样品中阿巴斯甜的测定,对比不同C18色谱柱的分离效果,结合各种色谱柱的表面性质,从而揭示出二者之间的关系。

右图为阿斯巴甜的结构:



实验部分


3.1 样品处理

准确称取酸奶5g左右,加入10mL1%三氯乙酸,1mL2%乙酸铅,颠倒数次,6000r/min 离心15min,取上清液于25mL容量瓶,5mLPH=4.3水洗涤沉淀, 6000r/min 离心10min,提取上清液,用PH=4.3水定容。将样品用0.45μm滤膜过滤,将样品进液相检测




3.2 液相条件

      仪器:Agilent HPLC 1200
  色谱柱见表1.


流动相:甲醇:水=6931

流速:0.8mL/min

进样量:20μL

检测波长:208nm




柱类型


长度

/mm


粒径/μm


孔径


%C


比表面㎡/g


封尾


封尾类型


PH


Venusil ASB C18


4.6*250


5


150


12%


200




-


0.8-7.5


Venusil XBP C18 (L)


4.6*250


5


150


15%


200




2


1.5-9.0


Venusil

AQ C18


4.6*250


5


100


18%


380




1


1.5-9.0


Venusil XBP

C18(2)


4.6*250


5


100


18%


380




1


1.5-9.0



实验结果

4.1 标液色谱图

1及图2是用阿斯巴甜的标准品在四款C18色谱柱上得到的谱图。当我们将流动相得pH4.3调整到3.0的时候,我们发现除了XBP C18(L)之外,其他色谱柱对阿斯巴甜的保留时间发生了前移。为什么会这样呢?原因是,C18色谱柱除了对阿斯巴甜有反相保留作用之外,还有解离羟基提供的弱离子交换作用。当流动相pH值降低的时候,羟基的解离被抑制,那么解离的羟基的数量减少,这样弱离子交换作用就被消弱了,导致阿斯巴甜的保留时间前移。而XBP C18(L)由于经过两次的封尾,解离的羟基几乎没有,它对阿斯巴甜的保留不依赖于弱离子交换作用,因此当流动相的pH变化的时候,阿斯巴甜在柱上的保留几乎不受影响。



4.2 酸奶样品色谱图

首先,需要知道几个数据,阿斯巴甜: pKa1= 3.3, pKa2=7.2;硅羟基:pKa= 5;蛋白质:pKa1=3-8?

当流动相pH值从4.3变化到3时,阿斯巴甜的解离状态变化不大,尤其是其氨基官能团在pH4.3时已经是充分解离了,变成pH3时,解离氨基的数量几乎没有变化。而硅羟基的pKa5,当流动相pH变成3的时候,偏离其pKa两个单位,使得硅羟基的解离被抑制,提供弱离子交换的作用被抑制,而不解离羟基的数量增加,提供的氢键极性吸附作用增加。而牛奶中的蛋白质种类较多,但是大部分在酸性条件下,会由于羧基解离的减弱,其反相保留作用会增加,因而蛋白质在C18色谱柱上的保留会变强。

3.1.1方法处理的酸奶样品进液相检测,也用4液相柱,流动相PH值由4.3调到3,看看会有什么变化?

    由图3可见,pH4.33,阿斯巴甜在ASB C18上保留时间前移,而蛋白质保留增加,产生了时间上的重叠,导致蛋白质对阿斯巴甜的干扰。



由图4可见,同样,在AQ C18上也是如此。



由图5可见,XBP C18(2)也是这样,不过它由于经过一次三甲基一氯硅烷的封尾,和前两个C18色谱柱相比,情况略微好些。



由图6可见,XBP C18L)由于阿斯巴甜几乎没有前移,它和蛋白质的分离度虽然减少,但是没有像前面三款色谱柱那样和蛋白质重叠在一起。


结论


    根据以上实验展示的规律,我们可以有以下结论:

1)碳含量的影响:

阿巴斯甜的保留时间随着碳含量递增

2)表面极性的影响:

阿巴斯甜和杂质(蛋白质等)分离随着表面极性的减弱越来越好。

3)没有不好的色谱柱,只有不合适的色谱柱。(所以以后再碰到某根色谱柱不能满足你分离杂质和目标物的目的,第一个想法不应该是否定色谱柱的性能,而是应该想想这根色谱柱适不适合用于这个实验,毕竟要找根万能的色谱柱是比较困难的)

4)根据样品和目标物去选择合适的色谱柱。
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yuduoling
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yigaozizi
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原文由 yuduoling(yuduoling) 发表:
楼主不参加原创大赛吗
参加呢!但是还没有通过审批呀~
yigaozizi
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以上实验是在选择色谱柱过程中发现的有趣现象,我把它们的联系整理了一下。还请大家多多指教呀~
jianhuilcn
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(1)碳含量的影响:

阿巴斯甜的保留时间随着碳含量递增


这个是从哪里看出来的呢?

LZ写得很好啊,学习了
jianhuilcn
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houjjun
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武灵
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经验分享,可以让大家少走弯路啊。
这色谱柱选择,是实验非常重要的一步。
nphfm2009
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haoyuee
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谢谢楼主分享这么好的文章。想请教下楼主,ASB C18在PH4.3时出现了双峰,他们的积分面积和PH3时相比如何。PH4.3时后面的较小峰是分裂还是杂质的影响,如果是分裂可否用楼主的弱离子交换作用来解释?
yigaozizi
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为什么我不能用“回复本帖”??
TO:jianhuilcn
1、阿斯巴甜保留时间与碳含量的关系,可以从3.2液相条件下的表格和图1或者图2看出来,从表格中可以查到不同型号色谱柱的碳含量。
2、PKa和PH的关系
需要解释一下,PKa:对于一个可生成离子的化合物,PKa是该化合物50%呈离子状态,50%呈中性状态的PH。
以弱酸HA的电离为例:
HA--H(+)+A(-)
[A-]/[HA]=10的(PH-PKa)次方
当PH-PKa=2时,HA基本是99%以上电离为离子态了

( ⊙ o ⊙ )啊!!!这么回复好麻烦啊~不知大家能不能看明白啊~~~
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