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主题：【第六届原创】液相色谱柱表面碳含量和极性对分离的影响

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yigaozizi
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发表于：2012/11/02 11:20:02 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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维权声明：本文为yigaozizi原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

色谱柱表面碳含量和极性对分离的影响



一 背景

    反相色谱柱如C18是色谱分析工作者在实验中经常使用的工具，但是不同种类的C18色谱柱往往表现不一样。

    本研究的目的是从C18色谱柱的表面性质去揭示影响分离效果的因素。主要考虑的表面性质有碳含量和表面极性（硅羟基数）。

二 实验原理

通过对阿巴斯甜标准品和酸奶样品中阿巴斯甜的测定，对比不同C18色谱柱的分离效果，结合各种色谱柱的表面性质，从而揭示出二者之间的关系。

右图为阿斯巴甜的结构：



三 实验部分

3.1 样品处理

准确称取酸奶5g左右，加入10mL1%三氯乙酸，1mL2%乙酸铅，颠倒数次，6000r/min 离心15min，取上清液于25mL容量瓶，5mLPH=4.3水洗涤沉淀， 6000r/min 离心10min，提取上清液，用PH=4.3水定容。将样品用0.45μm滤膜过滤，将样品进液相检测。




3.2 液相条件

      仪器：Agilent HPLC 1200
  色谱柱见表1.

流动相：甲醇：水=69：31

流速：0.8mL/min

进样量：20μL

检测波长：208nm




柱类型

长度

/mm

粒径/μm

孔径/Å

%C

比表面㎡/g

封尾

封尾类型

PH


Venusil ASB C18

4.6*250

5

150

12%

200

否

-

0.8-7.5


Venusil XBP C18 (L)

4.6*250

5

150

15%

200

是

2次

1.5-9.0


Venusil

AQ C18

4.6*250

5

100

18%

380

是

1次

1.5-9.0


Venusil XBP

C18(2)

4.6*250

5

100

18%

380

是

1次

1.5-9.0



四 实验结果

4.1 标液色谱图

图1及图2是用阿斯巴甜的标准品在四款C18色谱柱上得到的谱图。当我们将流动相得pH从4.3调整到3.0的时候，我们发现除了XBP C18(L)之外，其他色谱柱对阿斯巴甜的保留时间发生了前移。为什么会这样呢？原因是，C18色谱柱除了对阿斯巴甜有反相保留作用之外，还有解离羟基提供的弱离子交换作用。当流动相pH值降低的时候，羟基的解离被抑制，那么解离的羟基的数量减少，这样弱离子交换作用就被消弱了，导致阿斯巴甜的保留时间前移。而XBP C18(L)由于经过两次的封尾，解离的羟基几乎没有，它对阿斯巴甜的保留不依赖于弱离子交换作用，因此当流动相的pH变化的时候，阿斯巴甜在柱上的保留几乎不受影响。



4.2 酸奶样品色谱图

首先，需要知道几个数据，阿斯巴甜: pKa1= 3.3, pKa2=7.2；硅羟基:pKa= 5；蛋白质:pKa1=3-8?

当流动相pH值从4.3变化到3时，阿斯巴甜的解离状态变化不大，尤其是其氨基官能团在pH4.3时已经是充分解离了，变成pH3时，解离氨基的数量几乎没有变化。而硅羟基的pKa是5，当流动相pH变成3的时候，偏离其pKa两个单位，使得硅羟基的解离被抑制，提供弱离子交换的作用被抑制，而不解离羟基的数量增加，提供的氢键极性吸附作用增加。而牛奶中的蛋白质种类较多，但是大部分在酸性条件下，会由于羧基解离的减弱，其反相保留作用会增加，因而蛋白质在C18色谱柱上的保留会变强。

由3.1.1方法处理的酸奶样品进液相检测，也用4根液相柱，流动相PH值由4.3调到3，看看会有什么变化？

    由图3可见，pH从4.3到3，阿斯巴甜在ASB C18上保留时间前移，而蛋白质保留增加，产生了时间上的重叠，导致蛋白质对阿斯巴甜的干扰。



由图4可见，同样，在AQ C18上也是如此。



由图5可见，XBP C18(2)也是这样，不过它由于经过一次三甲基一氯硅烷的封尾，和前两个C18色谱柱相比，情况略微好些。



由图6可见，XBP C18（L）由于阿斯巴甜几乎没有前移，它和蛋白质的分离度虽然减少，但是没有像前面三款色谱柱那样和蛋白质重叠在一起。


五 结论

    根据以上实验展示的规律，我们可以有以下结论：

（1）碳含量的影响：

阿巴斯甜的保留时间随着碳含量递增

（2）表面极性的影响：

阿巴斯甜和杂质(蛋白质等)分离随着表面极性的减弱越来越好。

（3）没有不好的色谱柱，只有不合适的色谱柱。（所以以后再碰到某根色谱柱不能满足你分离杂质和目标物的目的，第一个想法不应该是否定色谱柱的性能，而是应该想想这根色谱柱适不适合用于这个实验，毕竟要找根万能的色谱柱是比较困难的）

（4）根据样品和目标物去选择合适的色谱柱。
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yuduoling
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2012/11/2 12:57:54 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主不参加原创大赛吗
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yigaozizi
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2012/11/2 13:19:04 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 yuduoling(yuduoling) 发表:
楼主不参加原创大赛吗
参加呢！但是还没有通过审批呀~
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yigaozizi
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2012/11/2 13:34:01 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
以上实验是在选择色谱柱过程中发现的有趣现象，我把它们的联系整理了一下。还请大家多多指教呀~
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jianhuilcn
jianhuilcn
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2012/11/2 17:48:21 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
（1）碳含量的影响：

阿巴斯甜的保留时间随着碳含量递增


这个是从哪里看出来的呢？

LZ写得很好啊，学习了
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jianhuilcn
jianhuilcn
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2012/11/2 17:55:24 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
请教一下LZ，pka和pH值的关系是怎样进行判断的。
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houjjun
houjjun
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2012/11/2 22:12:48 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
这个写的很好，可以得奖
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武灵
zhonghuashendun
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2012/11/2 22:51:50 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
经验分享，可以让大家少走弯路啊。
这色谱柱选择，是实验非常重要的一步。
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nphfm2009
nphfm2009
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2012/11/3 7:25:15 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
的确是一篇不错的文章，多交我们如何选拔色谱柱
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haoyuee
haoyuee
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2012/11/3 11:29:57 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
谢谢楼主分享这么好的文章。想请教下楼主，ASB C18在PH4.3时出现了双峰，他们的积分面积和PH3时相比如何。PH4.3时后面的较小峰是分裂还是杂质的影响，如果是分裂可否用楼主的弱离子交换作用来解释？
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yigaozizi
yigaozizi
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2012/11/5 13:55:30 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
为什么我不能用“回复本帖”？？
TO：jianhuilcn
1、阿斯巴甜保留时间与碳含量的关系，可以从3.2液相条件下的表格和图1或者图2看出来，从表格中可以查到不同型号色谱柱的碳含量。
2、PKa和PH的关系
需要解释一下，PKa：对于一个可生成离子的化合物，PKa是该化合物50%呈离子状态，50%呈中性状态的PH。
以弱酸HA的电离为例：
HA--H（+）+A（-）
[A-]/[HA]=10的(PH-PKa)次方
当PH-PKa=2时，HA基本是99%以上电离为离子态了

( ⊙ o ⊙ )啊！！！这么回复好麻烦啊~不知大家能不能看明白啊~~~
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