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主题：【求助】求助糖硅烷化衍生方法

浏览0 回复7 电梯直达
问小雅
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发表于：2015/09/18 16:30:53 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我要检测蜂蜜中的低聚糖主要包括二糖和三糖，想用HMDS衍生。
按照文献中的方法，标样溶解在80%乙醇中，氮吹干后，在55℃烘箱烘干30分钟，先加入200 uL 2.5%盐酸羟胺（溶于吡啶），此时溶液是澄清的，在75℃反应30min,然后加入200 uL  HMDS+TMS_PYRIDINE(3:1:9)衍生剂,  问题出现了，一加入衍生剂溶液就变白变浑浊，后来还产生了沉淀也是白色的。没有理会，继续45℃反应30min。想过膜进样。发现浑浊的反应液过膜后颜色还是发白看起来也是浑浊的。根本没法进样。
后来我吸了点HMDS+TMS_PYRIDINE(3:1:9)衍生剂到空离心管中，发现衍生剂也不是很澄清，看着有点发白浑浊的样子。是衍生剂失效了吗？
我分析可能出现问题的点：
（1）样品没有完全干燥，反应体系中有水，所以水和吡啶反应使溶液发白。
（2）购买的盐酸羟胺和吡啶都是分析纯的，是不是试剂纯度不够，所以后来加入衍生剂后和杂质反应。。。（猜想）
（3）就是购买的衍生剂有问题了，过期了。但是衍生剂是那种购买来就预混好的分装在1mL小管里的，平时都保存在4度冰箱。
希望论坛里各位大牛们帮忙分析下问题出在哪里，在此先谢过啦
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2015/9/18 22:32:27 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主的保存条件下，衍生试剂应该不会失效的。
楼主能不能试试不加样品的空白试验，看看有无沉淀呢？
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问小雅
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2015/9/21 8:10:42 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 symmacros(jimzhu) 发表:
楼主的保存条件下，衍生试剂应该不会失效的。
楼主能不能试试不加样品的空白试验，看看有无沉淀呢？
我下次做的时候试下，谢啦。
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问小雅
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2015/9/23 13:58:36 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
自己来回复：
第二次重复做了一遍，还是会变浑浊，有沉淀。反应完后离心，然后过膜进气质。发现衍生化效果还不错。
浑浊的原因可能就是反应体系中有水，有颗粒物的原因应该是盐酸羟氨盐不能被衍生化，所以会析出。多加点硅烷化衍生试剂，保证样品能充分衍生就ok.
接下来优化气相色谱条件。希望一切顺利。
该帖子作者被版主 cai008加 3积分， 2经验，加分理由：感谢反馈！
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2015/9/30 15:26:34 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
白色的就是 水解啦 糖可以用GC-MS做，不错
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千层峰
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2015/10/6 12:59:12 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 问小雅(v3037031) 发表:
自己来回复：
第二次重复做了一遍，还是会变浑浊，有沉淀。反应完后离心，然后过膜进气质。发现衍生化效果还不错。
浑浊的原因可能就是反应体系中有水，有颗粒物的原因应该是盐酸羟氨盐不能被衍生化，所以会析出。多加点硅烷化衍生试剂，保证样品能充分衍生就ok.
接下来优化气相色谱条件。希望一切顺利。
衍生试剂都是过量的，可以加多点
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问小雅
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2015/10/8 15:24:48 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 l777511b(l777511b) 发表:
白色的就是 水解啦 糖可以用GC-MS做，不错


你的意思是衍生产物，水解了吗？？
发白的样品进气质检测，也能检测到衍生产物。
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问小雅
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2015/10/8 15:34:12 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
关于糖HMDS衍生完反应产物是否可以保存的问题
亲身经验：由于放假的原因，将二糖标准品和蜂蜜样品的HMDS衍生反应物保存在-20℃冰箱3天，节后拿来上机检测，还是能检测到衍生产物。但是楼主没有进行定量分析，不知道衍生产物的具体分解率。
  衍生产物遇水会分解，所以只要避免水分，应该讲解不会很厉害。
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