主题:【已应助】LC-MSMS测定血浆药物浓度方法建立遇到的奇葩问题

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qhyy
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仪器:岛津LC-30A+AB triple quad 4500
项目:大分子抗菌药万古霉素的血药浓度方法建立
方法:加内标的LCMSMS
内容:线性8个点,定量下限LLOQ与定量上限HQC相差200倍浓度,内标采用去甲。血浆用1:3的乙腈沉淀,内标直接加在乙腈中,内标与待测物同时出峰,有一定拖尾(不拖尾的情况下问题依然存在)。
问题:实验中发现线性始终做不好,低浓度的五个点线性可以,高浓度的四个点线性也可以,合起来线性就总有一两个点超标。低浓度的五个点内标峰面积接近,但是高浓度的三个点的内标会比低浓度的五个点高很多,导致整体线性中高浓度的待测物测量值明显偏低。而如果把内标去掉的话,线性反而能达到要求,有不错的r值。
一般情况下加内标是为了降低操作误差与进样误差,但这里遇到的情况反尔因内标而导致线性无法通过。在这之前,因高浓度点的偏差怀疑过配样问题,分别采用过移液枪和移液管进行配样,但结果都一样,也没想到过会是内标的问题,不知道有谁遇到过此类问题,还望不吝赐教。
最佳答案:hujiangtao回复于2020/10/29
可能万古霉素不同浓度对内标物影响不一致,可以试着低浓度建一条曲线,高浓度再另外建曲线;另外万古霉素分子量大于1000,需要用双电荷准分子离子峰,可能对内标影响更大,比经常用的单电荷稳定性要差一些。
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hujiangtao
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可能万古霉素不同浓度对内标物影响不一致,可以试着低浓度建一条曲线,高浓度再另外建曲线;另外万古霉素分子量大于1000,需要用双电荷准分子离子峰,可能对内标影响更大,比经常用的单电荷稳定性要差一些。
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2020/11/1 10:36:49 Last edit by hujiangtao
qhyy
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原文由 hujiangtao(hujiangtao) 发表:可能万古霉素不同浓度对内标物影响不一致,可以试着低浓度建一条曲线,高浓度再另外建曲线
我这个线性范围参考了文献报道的定量下限与定量上限,报道中线性都很好,不知道为什么会有这样的问题。而且同一样品连续进样的误差也很大,峰面积的变异系数能达到8.24%,不过工程师说这正常,我很怀疑…这进样精密度偏差个人觉得有点大…严重影响结果…
hujiangtao
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原文由 qhyy(qhyy) 发表:
我这个线性范围参考了文献报道的定量下限与定量上限,报道中线性都很好,不知道为什么会有这样的问题。而且同一样品连续进样的误差也很大,峰面积的变异系数能达到8.24%,不过工程师说这正常,我很怀疑…这进样精密度偏差个人觉得有点大…严重影响结果…
万古霉素分子量1000多,用双电荷准分子离子峰,液质响应一般,低浓度容易出现RSD偏大
sdlzkw007
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qhyy
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原文由 sdlzkw007(sdlzkw007) 发表:图文并茂,不错的原创。
希望能引起讨论,解决问题
歌名
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先说峰面积变异系数哈,其实采用内标法的话再去单纯看峰面积变异系数就没太大意义,8%点几的峰面积变异系数其实真的是可以接受的,因为MS的额特性就这样,进样不是全部分析,雾化,碰撞,电离存在随机性。
第二个是线性关系问题,分俩部分,第一部分参考文献线性关系良好,自己做线性关系差(高浓度点响应值偏低),这个每个人做的环境条件,硬件条件等都不一样,变量因素太多,做不到一致是正常哈,文献大多是参考分析条件,色谱条件和方法,第二部分从自身分析方法角度去看你的线性关系差的话,其实想问一下自己有没有做个分析方法条件摸索,还是说只是照搬参考文献条件?MS端的分析条件不同仪器差异比较大,即使同一型号的都有差异,大部分都是要自己先测试,
qhyy
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原文由 歌名(Ins_eedcdc41) 发表:先说峰面积变异系数哈,其实采用内标法的话再去单纯看峰面积变异系数就没太大意义,8%点几的峰面积变异系数其实真的是可以接受的,因为MS的额特性就这样,进样不是全部分析,雾化,碰撞,电离存在随机性。第二个是线性关系问题,分俩部分,第一部分参考文献线性关系良好,自己做线性关系差(高浓度点响应值偏低),这个每个人做的环境条件,硬件条件等都不一样,变量因素太多,做不到一致是正常哈,文献大多是参考分析条件,色谱条件和方法,第二部分从自身分析方法角度去看你的线性关系差的话,其实想问一下自己有没有做个分析方法条件摸索,还是说只是照搬参考文献条件?MS端的分析条件不同仪器差异比较大,即使同一型号的都有差异,大部分都是要自己先测试,
当然没有照搬文献的条件,自己根据指南依据血药浓度设置了浓度范围,然后与文献对比了下,发是一致的。然后是关于条件摸索这一块,先是采用AB4500的Mass only进行了调谐,然后用针泵模式进行待测物和内标的质谱条件优化,确定好了各自的参数后,再采用LC-MSMS模式对液相条件进行了优化,然后再进行线性测试的。现在遇到的情况就是高浓度点下线性通不过。该情况在工程师培训时也遇到过,当时工程师用的自带柱子峰的对称性很好,没有通过以为是配样稀释问题。后来自己做,用的waters x-Bridge柱,对称性不太好,不过也能接受,线性到了高点通不过。前后两者对比,发现问题类似,都是到了高浓度点内标峰面积会增大约40%,因为不加内标算的话,线性是能通过的,加内标算的话线性反尔通不过了。
图中是定量上限下的总离子流图和待测物内标的峰。
qhyy
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通过分析数据发现,还是内标有问题,内标峰面积会随着待测物浓度增加而发生显著的增加,进而导致线性的不准确。
抗敏感青年
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1.每个浓度点内标的加样量是否一致?
2.另外,进一下内标单标,看看内标里面是否存在未标记的分析物
3.从图中可以看出,你的内标浓度太低了,相应还不到E4,可以加大内标浓度再重新做标曲,内标浓度太低会影响标曲的线性
qhyy
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原文由 抗敏感青年(v3048285) 发表:1.每个浓度点内标的加样量是否一致?2.另外,进一下内标单标,看看内标里面是否存在未标记的分析物3.从图中可以看出,你的内标浓度太低了,相应还不到E4,可以加大内标浓度再重新做标曲,内标浓度太低会影响标曲的线性
确实,问题解决了,就是内标浓度太低造成的