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液质联用（LCMS）

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主题：【已应助】LC-MSMS测定血浆药物浓度方法建立遇到的奇葩问题

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qhyy

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发表于：2020/10/29 19:35:23 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

仪器：岛津LC-30A+AB triple quad 4500
项目：大分子抗菌药万古霉素的血药浓度方法建立
方法：加内标的LCMSMS
内容：线性8个点，定量下限LLOQ与定量上限HQC相差200倍浓度，内标采用去甲。血浆用1：3的乙腈沉淀，内标直接加在乙腈中，内标与待测物同时出峰，有一定拖尾（不拖尾的情况下问题依然存在）。
问题：实验中发现线性始终做不好，低浓度的五个点线性可以，高浓度的四个点线性也可以，合起来线性就总有一两个点超标。低浓度的五个点内标峰面积接近，但是高浓度的三个点的内标会比低浓度的五个点高很多，导致整体线性中高浓度的待测物测量值明显偏低。而如果把内标去掉的话，线性反而能达到要求，有不错的r值。
一般情况下加内标是为了降低操作误差与进样误差，但这里遇到的情况反尔因内标而导致线性无法通过。在这之前，因高浓度点的偏差怀疑过配样问题，分别采用过移液枪和移液管进行配样，但结果都一样，也没想到过会是内标的问题，不知道有谁遇到过此类问题，还望不吝赐教。

推荐答案：hujiangtao回复于2020/10/29

可能万古霉素不同浓度对内标物影响不一致，可以试着低浓度建一条曲线，高浓度再另外建曲线；另外万古霉素分子量大于1000，需要用双电荷准分子离子峰，可能对内标影响更大，比经常用的单电荷稳定性要差一些。

该帖子作者被版主 hujiangtao加 5积分， 2经验，加分理由：鼓励发帖

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2020/10/29 19:49:39 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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2020/11/1 10:36:49 Last edit by hujiangtao

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2020/10/29 19:56:47 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 hujiangtao(hujiangtao) 发表:可能万古霉素不同浓度对内标物影响不一致，可以试着低浓度建一条曲线，高浓度再另外建曲线

我这个线性范围参考了文献报道的定量下限与定量上限，报道中线性都很好，不知道为什么会有这样的问题。而且同一样品连续进样的误差也很大，峰面积的变异系数能达到8.24%，不过工程师说这正常，我很怀疑…这进样精密度偏差个人觉得有点大…严重影响结果…

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2020/10/29 21:03:29 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 qhyy(qhyy) 发表:
我这个线性范围参考了文献报道的定量下限与定量上限，报道中线性都很好，不知道为什么会有这样的问题。而且同一样品连续进样的误差也很大，峰面积的变异系数能达到8.24%，不过工程师说这正常，我很怀疑…这进样精密度偏差个人觉得有点大…严重影响结果…

万古霉素分子量1000多，用双电荷准分子离子峰，液质响应一般，低浓度容易出现RSD偏大

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2020/10/30 8:13:52 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

图文并茂，不错的原创。

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2020/10/30 8:58:32 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 sdlzkw007(sdlzkw007) 发表:图文并茂，不错的原创。

希望能引起讨论，解决问题

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2020/10/30 9:13:55 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

先说峰面积变异系数哈，其实采用内标法的话再去单纯看峰面积变异系数就没太大意义，8%点几的峰面积变异系数其实真的是可以接受的，因为MS的额特性就这样，进样不是全部分析，雾化，碰撞，电离存在随机性。
第二个是线性关系问题，分俩部分，第一部分参考文献线性关系良好，自己做线性关系差（高浓度点响应值偏低），这个每个人做的环境条件，硬件条件等都不一样，变量因素太多，做不到一致是正常哈，文献大多是参考分析条件，色谱条件和方法，第二部分从自身分析方法角度去看你的线性关系差的话，其实想问一下自己有没有做个分析方法条件摸索，还是说只是照搬参考文献条件？MS端的分析条件不同仪器差异比较大，即使同一型号的都有差异，大部分都是要自己先测试，

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2020/10/30 9:39:14 7楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 歌名(Ins_eedcdc41) 发表:先说峰面积变异系数哈，其实采用内标法的话再去单纯看峰面积变异系数就没太大意义，8%点几的峰面积变异系数其实真的是可以接受的，因为MS的额特性就这样，进样不是全部分析，雾化，碰撞，电离存在随机性。第二个是线性关系问题，分俩部分，第一部分参考文献线性关系良好，自己做线性关系差（高浓度点响应值偏低），这个每个人做的环境条件，硬件条件等都不一样，变量因素太多，做不到一致是正常哈，文献大多是参考分析条件，色谱条件和方法，第二部分从自身分析方法角度去看你的线性关系差的话，其实想问一下自己有没有做个分析方法条件摸索，还是说只是照搬参考文献条件？MS端的分析条件不同仪器差异比较大，即使同一型号的都有差异，大部分都是要自己先测试，

当然没有照搬文献的条件，自己根据指南依据血药浓度设置了浓度范围，然后与文献对比了下，发是一致的。然后是关于条件摸索这一块，先是采用AB4500的Mass only进行了调谐，然后用针泵模式进行待测物和内标的质谱条件优化，确定好了各自的参数后，再采用LC-MSMS模式对液相条件进行了优化，然后再进行线性测试的。现在遇到的情况就是高浓度点下线性通不过。该情况在工程师培训时也遇到过，当时工程师用的自带柱子峰的对称性很好，没有通过以为是配样稀释问题。后来自己做，用的waters x-Bridge柱，对称性不太好，不过也能接受，线性到了高点通不过。前后两者对比，发现问题类似，都是到了高浓度点内标峰面积会增大约40%，因为不加内标算的话，线性是能通过的，加内标算的话线性反尔通不过了。
图中是定量上限下的总离子流图和待测物内标的峰。