主题：【第十七届原创】反向液相色谱柱使用过程中的常见问题及排查经验分享

反向液相色谱柱使用过程中的常见问题及排查经验分享

张永梅

（重庆市计量质量检测研究院，杨柳北路1号 401123）

液相色谱柱，是我们在检测过程中常用且必不可少的工具，但你的色谱柱安装对了吗？在拿到新的色谱柱时如何进行活化（老化）处理？如何平衡柱子？实验完成后，如何清洗和保存柱子？你有一根新的色谱柱，但一进样就峰拖尾，是我的色谱柱坏了吗？什么原因导致色谱峰的保留时间变化？下面是我将对这些问题进行回答，供大家参考，希望能为正在使用色谱柱的你提供帮助，本文提到的色谱柱和系统均为反相，如果你使用的为正向液相色谱，不做参考。


问题一：如何正确安装色谱柱?

不同生产厂家的色谱柱接头和连接管路会有所差异。在安装新色谱柱时，必须确保连接管路与色谱柱接头匹配。



如上图所示。Waters厂家的色谱柱的接头通常比其他厂家的长，如果使用其他厂家的连接管路连接色谱柱时，会出现连接管路比色谱柱接头短，产生死体积，导致样品扩散，峰出现拖尾现象，色谱柱的柱体积越小，峰拖尾越严重。同理，当使用Waters厂家的连接管路连接其他厂家的色谱柱时，会出现连接管路比色谱柱接头长，螺纹不能密封色谱柱，导致漏液，在低流速和高柱温下，不易发现漏液现象，但色谱峰的保留时间可能会发生不规则漂移。


问题二：新的色谱柱如何活化色谱柱?

1、如果系统使用了含有缓冲盐的流动相，首先在不连接色谱柱的情况下，用100%的超纯水冲洗系统5~10 min，然后用100%有机流动相冲洗系统。完成后将色谱柱入口端连接至系统中。

注意：使用含有缓冲盐的系统，在冲洗的时候一定不能直接用有机相进行冲洗，有机相与缓冲盐接触，会导致缓冲盐析出，堵塞我们放入系统和管路。

2、如果色谱柱的内径为4.6 mm，流速设置为0.1 mL/min，用100%有机流动相冲洗色谱柱，在5 min内将流速增至0.5 mL/min。同理如果色谱柱的内径为2.1mm，流速设置为0.05 mL/min，在5 min内将流速增至0.2 mL/min。查看色谱柱出口端。

(a)如果短时间内看到流动相流出，停止流速，进行下一步。

(b)如果长时间才看到流动相流出，且伴随气泡，表明色谱柱在存放时没有密封紧，柱内溶剂已经挥发。这时继续保持有机溶剂流速，冲洗色谱柱1~2h，再进行下一步。

3、 将色谱柱出口端连接至检测器。继续用50%的甲醇/乙腈水溶液活化色谱柱。没有活化好的色谱柱，可能会出现柱效低、保留时间漂移。


问题三：在开始实验时，如何平衡色谱柱?

每次实验前，用至少10倍柱体积的初始流动相来平衡柱子，当基线稳定，开始进样。流动相中含有体积比小于0.2% 的离子对试剂，需要100~200倍柱体积的初始流动相平衡柱子。当流动相中含有甲酸铵、甲酸等具有挥发性的添加剂时，需要更长的平衡时间。色谱柱的柱体积如下图所示。




问题四：实验完成后，如何清洗和保存色谱柱?

实验完成后，我会加上两针冲洗柱子的方法，先用高水相冲洗柱子20min去除掉含有含盐类等溶于水的污染物，然后逐渐增加有机相的比例冲洗柱子去除不溶于水的非极性污染物，最后使柱子保存在纯有机相中。流动相中如果含有缓冲盐，先用10倍柱体积的95%的超纯水冲洗色谱柱，冲洗时间一般控制在5min，色谱柱一般不耐高水相，不能用纯水和高水相冲洗柱子太久，容易造成柱效下降，彻底清除柱内的盐成分后，再按照前方法冲洗柱子保存。将色谱柱完全密封，防止溶剂蒸发导致柱床变干，密封色谱柱的时候最好使用相匹配的堵头，不同生产厂家的堵头可能会长短不一致，造成封堵不严的情况。


问题五：新柱子，一进样就拖尾，是什么问题呢?

1、 色谱柱不适合该类物质的分析，可以换一根色谱柱进行测试或换其他物质进行测试，看色谱峰是否正常，如果该类物质在旧色谱柱能正常出峰，新的色谱柱上不出峰，旧的色谱柱可能被离子对条件或其他改性条件使柱子的性能发生变化?

2、 检查管路与色谱柱连接有无死体积，样品出峰时间过早，进样体积过大，系统管路中是否有气泡、漏液等情况。色谱柱的内径、体积越小，系统死体积的影响就越大。出峰时间越早，越容易受系统死体积影响，建议HPLC系统的最早出峰时间建议在10分钟，UHPLC系统的最早出峰时间建议在5分钟。进样体积越大，样品溶剂会导致峰拖尾，HPLC系统最小进样量可以到1μL，UHPLC系统最小进样量可以到0.1μL。当然，在调进样量的过程中我们也要考虑到灵敏度是否满足要求。

3、如果以上均排查后峰仍然拖尾，则需要测试柱子的柱效，考虑柱子柱效下降的情况。


问题六：色谱峰的保留时间不稳定，是什么问题呢?

1、首先要找到保留时间的变化趋势，如果保留时间在每次进样过程中随机变化，可能是泵和溶剂混合装置的原因。可以用量筒和秒表验证泵的流速是否正常。如果溶剂混合装置发生问题，流动相的比例可能发生变化，可以在有机相中加入0.1%的丙酮（跟踪剂），在UV检测器波长为254nm下，观察基线的变化情况；也可以预先配制好流动相，进样，如果保留时间恢复正常，说明问题发生在溶剂混合装置上。

2、相同的流动相，重新配制后保留时间变化。仪器本身不太可能有问题，问题主要在流动相上。在反相色谱中，如果我们是预先将有机相和水相混合在一起，有机溶剂的含量对保留时间有很大的影响，有机溶剂的含量误差为1%，保留时间的变化在5%~15%，所以我们在配制流动相的时候，最好用有机溶剂的质量代替体积，此外，脱气也可能导致有机溶剂的挥发，我们经常使用的是超声脱气，这个过程注意不要太久。流动相的pH值也可能影响保留时间，0.1单位的pH值变化0.1可能导致保留时间变化10%左右。

3、保留时间向一个方向变化，可能是温度导致保留时间的变化，温度每变化1℃，保留时间的变化在1%~2%。缓冲溶液的浓度也会导致保留时间的变化，浓度小于5mM/L时，保留时间与离子对试剂浓度成正比；浓度大于10mM/L时，色谱柱填料表面达到饱和，对保留时间的影响下。

结语：在我们实验过程中，小小的问题可能给你的实验结果带来很大的影响，我们必须做好每一步，才能保证我们实验的顺利进行，希望大家每次实验都成功了。