主题：【分享】【“仪”起享奥运】自动化微生物鉴定

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发表于：2024/08/09 19:37:18 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

自动化微生物鉴定主要用于细菌的鉴定，其工作原理因仪器不同而略有差异。该系统结合光电比色技术、荧光检测技术和微生物数值编码鉴定技术，自动对数据进行处理分析，得出最后结果。半自动微生物鉴定系统的测试卡在机外孵育后，需人工转至机器上读取结果。

微生物鉴定原理

微生物鉴定原理主要基于微生物各自的酶系统不同，新陈代谢的产物与相应底物生化反应的颜色变化各不相同。而试验结果的准确度取决于鉴定系统配套培养基制备方法、培养物浓度、孵育条件和结果判定等。大多数鉴定系统采用细菌分解底物后，反应液中pH的变化、色原性或荧光原性底物的酶解、测定挥发或不挥发酸、识别是否生长等方法来分析鉴定细菌。如果排序第一的细菌鉴定值（%id）≥80.0，则可将未知菌鉴定在此条目中，并按此值的大小对鉴定的可信度作出评价。如%id≥99.9为极好的鉴定；%id 在99.0~99.8为非常好的鉴定；%id 在90.0~98.9 为好的鉴定；% id 在80.0~89.9为可接受的鉴定。若%id <80.0，则需进一步做纯培养，重新鉴定。微生物鉴定的原理主要有以下几种。

1.光电比色技术 每张鉴定卡包含30余项生化反应，仪器采用光电比色法测定细菌因分解底物导致pH 改变或由于细菌生长利用底物而引起的透光度变化、以变化百分率作为判断每项生化反应的变量值。在每一张测试卡中设有终点指示孔，在仪器的存储器中有相应的指示终点的阈值。在计算机的控制下，读数器每隔一定的时间对各个反应孔扫描一次，测取各个反应孔的吸光度值，并计算出变化的百分率，一旦终点指示孔的变化百分率达到终点阈值，提示该卡已完成反应。仪器在每一次读取数值后，自动将所测取的数据与存储在硬盘中的菌种资料库标准菌生物模型相比较，由电脑分析得出的结果作出鉴定。

常见的生化反应如下：

（1）碳水化合物的代谢试验：

①糖（醇、苷）类发酵试验；是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验。不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物也可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。

②葡萄糖代谢试验：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参与，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型細菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F）试验，可用于区别细菌的代谢类型。

③甲基红（MR）试验：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培养基pH 下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基PH 在5.4以上，加入甲基红指示剂呈橘黄色。

（2）氨基酸和蛋白质的代谢试验：主要包括：①硫化氢试验：某些细菌能分解含硫氨基酸生成硫化氢，与亚铁离子或铅离子结合形成黑色沉淀物；②吲哚试验：某些细菌有色氨酸酶，能分解色氨酸产生吲哚，吲哚与对三甲氨基苯甲醛形成红色的玫瑰吲哚。

（3）碳源和氮源利用试验：①枸橼酸盐利用试验：某些细菌能利用枸橡酸盐作为唯一碳源而在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐生成碳酸钠，使培养基变碱性；②丙二酸盐利用试验：某些细菌能利用丙二酸盐作为唯一碳源，丙二酸盐被分解生成碳酸钠，使培养基变碱性。

（4）酶类试验：①氧化酶试验：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。此酶并不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。②触酶试验：触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。

2.荧光测定技术 根据荧光法的鉴定原理，荧光物质均匀地混在培养基中，将菌种接种到鉴定板后，通过检测荧光底物的水解、底物被利用后的pH 变化、特殊代谢产物的生成和某些代谢产物的生成率，将荧光信号转换成电信号，数据管理系统将这些电信号转换成数字信息，与原已储存的对照值相比较，推断出菌种的类型。

3.微生物数值编码鉴定技术 数码鉴定的基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和，即通过数学的编码技术将组菌的生化反应模式转换成效学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅数据库，得到细菌名称。

4.质谱技术 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight- mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）是20世纪80年代发展起来的一种汉进分析大分子的方法，现已广泛应用于生命科学及相关领域，是检测和鉴定蛋白质、多糖、核酸等生物分子的有力工具。用质谱技术对微生物进行鉴定，是对传统的基于生化及表型测定鉴定微生物方法的补充，也是临床微生物鉴定技术发展的一个新里程。也有人预言，MALDI-TOF-MS 将取代传统的生化鉴定法，成为临床微生物实验室进行微生物鉴定的主要技术。分析前，待测样品与化学基质一起点种在样品盘上，所选择的基质在仪器的测定波长能有良好的吸收。点种完后，样品盘被放入样品解析/电离室，样品与基质的混合物接收激光脉冲照射，使基质活化。样品分子被活化的基质分子、水和离子所包围。一旦吸收，基质便将自身的质子传递给样品分子，使样品分子在气化状态均带正电荷。在电离室电场的作用下样品分子加速通过，且速度与质荷比相关。粒子通过电离室后进入飞行时间质谱分析器，在这里，带电粒子沿着无电场的路径飞行，最后到达粒子检测器。具体的飞行时间由粒子检测器测得。从飞行时间可以计算出每种粒子的质荷比，从而绘出样品复合物的质谱图。

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