主题：【分享】【“仪”起享奥运】基于HPLC与化学计量法的不同年限林下参茎、叶中皂苷类成分比较分析

人参首载于《神农本草经》，性味甘、微苦、微温，归脾、肺、心、肾经，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智的功效。人参为五加科植物人参Panax ginseng C. A. Mey.的干燥根及根茎^[1]。栽培人参俗称“园参”，播种在山林野生状态下自然生长的称林下山参，习称“籽海”^[2]，林下参有人为干扰少、生长周期长和绿色安全的优点。

人参皂苷有多种生物学活性，为人参中主要有效成分，同时也被认为是人参的药效物质基础^[3-4]。人参皂苷根据皂苷元的结构分为原人参二醇型、原人参三醇型、齐墩果酸型3类。原人参二醇型包括人参皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃、Rd，人参三醇型包括人参皂苷Rg₁、Re、Rf、Rg₂，齐墩果酸型包括人参皂苷Ro^[5-10]。近年来，国内外学者对于人参化学成分的研究逐渐向非药用部位发展^[11]。有研究表明，人参花蕾和人参茎叶中的部分皂苷含量远远高于人参根中^[6-8]。据统计，我国每年人参茎叶总产量可达人参产量的40%～48%，且近年来产量逐年增加，市场价格却只有人参的1/50。研究发现，林下山参茎叶中含有更为丰富的化学成分^[7,10,12-13]，其药用价值优于园参茎叶。因此，深度开发林下参茎叶对人参资源的综合开发具有十分重要意义^[14]。

1 仪器与材料1.1 仪器Thermo Ultimate 3000型高效液相色谱仪（美国赛默飞公司）；Q-600E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AB135-S型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）：DHG-90700A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。1.2 材料人参皂苷Rg₁对照品（批号DSTDR000901，质量分数≥98%），人参皂苷Rg₂对照品（批号DSTDR001001，质量分数≥98%），人参皂苷Ro对照品（批号DST191226-031，质量分数≥98%），人参皂苷Rb₁对照品（批号DSTDR000601，质量分数≥98%），人参皂苷Rb₃对照品（批号DSTDR000804，质量分数≥98%），以上均购自乐天美医药德思特生物有限公司；人参皂苷Rd对照品（批号Z09A9X67397，质量分数≥98%），人参皂苷Re对照品（批号B10M8S35243，质量分数≥98%），人参皂苷Rf对照品（批号P13S9L70209，质量分数≥98%），人参皂苷Rc对照品（批号M1M9S61061，质量分数≥98%），人参皂苷Rb₂对照品（批号P25D8F51140，质量分数≥98%），均购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈（批号F22M9J202）色谱纯，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。甲醇（批号20201205）分析纯，购自天津市江杭化工科技有公司。磷酸（批号20201110）分析纯，购自福晨（天津）化学试剂有限公司。水为屈臣氏饮用水，购自广州屈臣氏食品饮料有限公司。课题组于2022年9月在吉林省长白山采摘10、15、20、25年林下参茎叶，所有样品经长春中医药大学肖井雷副教授鉴定为五加科植物人参P. ginsengC. A. Mey.的茎、叶。趁鲜将林下参的茎、叶分开，其中10年生林下参茎（编号J1～J6），15年林下参茎（编号J7～J12），20年林下参茎（编号J13～J18），25年林下参茎（编号J19～J24）；10年林下参叶（编号Y1～Y6），15年林下参叶（编号Y7～Y12），20年林下参叶（编号Y13～Y18），25年林下参叶（编号Y19～Y24）。2 方法与结果2.1 色谱条件安捷伦ZORBAX SB-Aq C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱（0～30 min，81% A；30～40 min，81%～71% A；40～70 min，71% A；70～80 min，71%～68% A；80～90 min，68%～58% A），检测波长为203 nm；柱温26.5 ℃；进样量10 μL；体积流量1 mL/min。理论塔板数按人参皂苷Rb₁峰计算应不低于5 000^[15]。混合对照品溶液及4种年限林下参茎、叶样品溶液色谱图见图1。

2.2 对照品溶液制备精密称定人参皂苷Rg₁、Re、Rf、Rg₂、Ro、Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃、Rd对照品适量，加甲醇溶解制成约1 mg/mL的单一对照品溶液，吸取单一对照品适量，加甲醇溶解，定容，制成含有人参皂苷Rg₁ 1.680 0 mg/mL、人参皂苷Re 1.830 0 mg/mL、人参皂苷Rf 0.005 0 mg/mL、人参皂苷Rg₂ 0.135 0 mg/mL、人参皂苷Ro 0.115 0 mg/mL、人参皂苷Rb₁ 0.132 0 mg/mL、人参皂苷Rc 0.760 0 mg/mL、人参皂苷 Rb₂ 0.220 0 mg/mL、人参皂苷Rb₃ 0.013 8 mg/mL、人参皂苷Rd 1.12 mg/mL的混合对照品溶液。2.3 供试品溶液制备分别取10、15、20、25年林下参茎、叶样品各6批于室温下烘干，粉碎，过四号筛。取不同年限 林下参茎、叶粉末0.2 g，加4 mL甲醇溶解，超声提取30 min。过0.22 μm微孔滤膜，为待测液，即为不同年限林下参茎、叶供试品溶液。2.4 方法学考察2.4.1  线性关系考察  取混合对照品溶液分别稀释1、2、10、50、100、200倍，按“2.1”项下色谱条件进样10 μL，记录峰面积，以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果见表1。

2.4.2  精密度试验  取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续测定6次，记录峰面积，计算得到上述10种人参皂苷峰面积的RSD为0.01%～0.11%，表明该仪器精密度良好。2.4.3  稳定性试验  取供试品溶液按“2.1”项色谱条件分别于制备后0、6、12、24、36、48 h进样，测定，记录峰面积，计算得到上述10个成分峰面积的RSD为1.21%～2.47%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。2.4.4  重复性试验  取同一批（Y7）林下参茎叶，制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得到上述10个成分质量分数的RSD为1.11%～2.12%，表明该方法重复性良好。2.4.5  加样回收率试验 取已测定含量的林下参茎、叶供试品溶液6份，精密加入个对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算得到人参皂苷Rg₁、Re、Rf、Rg₂、Ro、Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃、Rd的加样回收率分别为102.54%、103.87%、99.43%、100.56%、98.69%、99.22%、100.89%、101.90%、97.75%、102.64%，RSD值为1.96%、1.00%、1.06%、1.96%、1.23%、1.08%、0.96%、2.66%、1.86%、1.45%。2.5 含量测定取不同年限林下参茎、叶样品溶液各6批，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。HPLC色谱图及不同年限人参茎、叶HPLC色谱图见图1，计算样品中10种人参皂苷含量，结果见表2。林下参茎中未检测到人参皂苷Rb₂、Rb₃。皂苷含量叠加图见图2，计算原人参二醇型、原人参三醇型、齐墩果酸型皂苷含量随时间变化折线图如图3所示。为更直观地反映不同年限林下参茎、叶中皂苷含量差异，将含量测定结果导入OriginPro 2019软件，对数据归一化处理后，进行热图聚类分析，结果见图4。林下参叶中10年及25年聚为一类，15年及20年聚为一类，林下参茎中10年及15年聚为一类，20年及25年聚为一类。差异性指标成分人参皂苷Re及人参皂苷Rg₁在林下参叶15年时含量达到峰值，人参皂苷Rd及人参皂苷Rc在林下参叶20年时含量达到峰值。4种年限林下参中10中皂苷总量呈现林下参叶＞林下参茎的趋势。含量有显著差异。4种年限林下参茎、叶皂苷含量随年份的增长呈先上升后下降趋势，20年时林下参茎、叶中10种皂苷总量达到最高。4种年限林下参叶中10中皂苷含量20年＞15年＞10年≈25年，4种年限林下参茎中皂苷含量20年＞25年＞15年＞10年。
林下参叶中原人参二醇型皂苷随年份的增长先升高后降低，20年时最高，原人参二醇型皂苷含量20年＞25年＞15年＞10年；原人参三醇型皂苷含量随年份增长先升高后降低，15年时最高，原人参三醇型皂苷含量15年＞20年＞10年＞25年；齐墩果酸型皂苷质量分数为0.5～1.0 mg/g。林下参茎中原人参二醇型皂苷质量分数0.3～1.0 mg/g，林下参茎中原人参三醇型皂苷质量分数3.0～5.0 mg/g。3 多元统计分析3.1 主成分分析（principle component analysis，PCA）将表2含量测定结果导入SIMCA14.0软件，以10种人参皂苷成分为变量，进行PCA，其中R²_X＝0.983，Q²＝0.924表示模型成立可靠，预测率高。图5从整体上看，不同年限林下参茎、叶2个部位分布在轴的两侧，在PCA模型中达到较好的分离效果，说明二者之间的皂苷类成分存在差异。10年与15年林下参叶相近，10年与20林下参茎相近，化学成分可能具有相似性。
3.2 正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）将48批林下参茎、叶样品含量数据导入SIMCA软件，建立OPLS-DA模型，结果如图6所示。其中（R²_X＝0.94，R²_Y＝0.837，Q²＝0.821）表明所建立模型可以描述大部分数据，具有良好的预测能力，可用于林下参茎、叶样品的分析。由图6可知，不同年限林下参茎样品聚为一堆，表明年限对林下参茎中皂苷含量没有显著影响。24批不同年限林下参叶样品被分为4类，其分类结果与PCA一致，证明结果可靠。建立变量重要性投影（VIP）值图，以此来筛选不同年限林下参茎、叶的差异性标志物，结果如图7所示。VIP图表示，在95%置信区间内，一般选择VIP＞1作为筛选差异性成分指标。VIP值＞1的成分有人参皂苷Re、Rd、Rg₁和Rc，说明人参皂苷Re、Rd、Rg₁和Rc为不同年限林下参茎、叶的差异性指标成分。200次置换检验结果见图8，所有置换检验的R²和Q²值均小于所建立模型原始值，并且Q²的回归线在y轴上截距为负值，表明所建立模型没有过拟合，并且具有良好的拟合度和预测能力。

4 讨论本实验采用HPLC法对4种年限林下参茎、叶样品中10种皂苷含量测定，筛选差异性化学成分，比较4种年限林下参茎、叶中原人参二醇型、原人参三醇型、齐墩果酸型皂苷含量。结果显示，在林下参茎中未检测到人参皂苷Rb₂、Rb₃，林下参叶中10种皂苷含量远高于林下参茎中。在4种年限林下参叶中，10种人参皂苷总量在60～100 mg/g，20年时含量最高；在4中年限林下参茎中，除人参皂苷Rb₂、Rb₃外的8中人参皂苷总量在20年最高；原人参二醇型皂苷20年林下参中最高。原人参三醇型皂苷在15年林下参叶中皂苷含量最高；4种年限林下参茎、叶中差异性成分为人参皂苷Re、Rd、Rg₁和Rc。林下参茎叶总皂苷可通过促进免疫低下小鼠的细胞免疫、体液免疫来增强免疫抑制小鼠的免疫功能，林下参茎叶总皂苷还可通过增强免疫发挥抗肿瘤活性^[13,16]。本研究发现，林下参茎叶中皂苷类成分主要集中在叶，不同年限的林下参叶中皂苷含量不同可能会导致药效的不同，因此不同年限林下参叶间的药效差异仍需进一步探讨。生长年限对林下山参茎、叶皂苷含量影响显著，同时，10种皂苷、原人参二醇型、原人参三醇型、齐墩果酸型皂苷含量随生长年限变化规律差异很大，皂苷增加的量并不是与年生长量呈等比关系，原因可能是人参生长到一定年限，其活性物质的累计率会降低^[17]。我国的人参种植面积、总产量均居世界首位，每年用于出口、医药健康领域及功能性食品开发方面逐年加大，药用植物资源需求明显增多^[14]。由于人参产量的大幅增加，人参茎叶等非药用部位的产量逐年增加，现代工业生产人参单体皂苷多选择以人参茎叶为原料，提取总皂苷，再进一步纯化、结构修饰得到人参单体皂苷^[18-19]。研究发现，人参叶质量占人参茎叶质量的25%，其中总皂苷含量远高于人参茎中皂苷含量^[20]。由此可推断，可根据提取的皂苷成分不同，有针对性的选择不同生长年限的林下参茎、叶，可有效提高提取效率。人参非药用部位的开发与利用势在必行。本研究从不同生长年限林下参茎、叶出发，考察其中10种皂苷含量及其变化规律。为林下参非药用部位资源的开发与利用提供理论依据。