主题：【分享】滇黄精炮制前后化学成分变化研究

黄精为百合科黄精属植物滇黄精Polygonatμm kingianum Coll. et Hemsl.、黄精P. sibiricum Delar. ex Redoute、多花黄精P. cyrtonema Hua的干燥根茎。黄精富含多糖、多酚、皂苷、氨基酸等活性物质和各种微量元素。传统中医认为黄精具有好颜色、润泽，除风湿、安五脏，久服轻身、延年、不饥等药效，可炮制后直接食用，或煎熬成汁而服。现代药理学研究表明，黄精具有预防糖尿病、抑制癌症、治疗老年痴呆、抗炎抗菌、抗氧化活性、增强免疫力、预防骨质疏松等功效[1-3]。
鲜黄精有强烈刺激性，能致使口舌麻木，故需炮制，方可入药或食用。黄精的炮制过程必然伴随着物质成分的变化，多数研究都针对各地产黄精的五羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）、多糖、皂苷、浸出物含量变化上进行讨论[4-8]。滇黄精产品和市场份额在黄精品种中占比最大，主产于云南，在《滇南本草》《云南植物志》中均有记载，是一味重要的“云药”[7]。滇黄精与黄精和多花黄精具备相似的生理活性，如抗氧化、降血糖、增强免疫力等功效。但是滇黄精炮制工艺众多，炮制过程中化学成分变化规律不清晰，亟待解决。
代谢组学是近年来新兴的一门组学技术，应用高通量检测和数据处理相结合，来分析整体代谢物的变化，进而推测其背后的生理和病理机制[9]。由于代谢组学的整体观与多组分、多靶点的特点相一致，为植物学和食品功能营养学研究提供了有力的工具[10]。代谢组学不仅在阐明植物生长过程中的生理、病理现象和代谢途径方面发挥着重要作用，而且在分析采后加工功能成分的代谢变化机制方面也发挥着重要作用。
本实验以滇黄精为研究对象，采用传统“九蒸九晒”炮制工艺，以分光光度检测、HPLC和代谢组等技术研究炮制过程化学物质变化规律以探究炮制机制，以期揭示炮制过程中物质变化规律，为滇黄精炮制工艺的规范化、炮制品质量的标准化提供理论依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
TU-190型双光束紫外可见分光光度计，上海析谱仪器有限公司；SHZ-DIII型循环水式真空泵，巩义市于华仪器有限责任公司；DHG-9070A型台式鼓风干燥箱，上海东麓仪器设备有限公司；ZL2-80A型超声波清洗器，上海左乐仪器有限公司；Applied Biosystems 4500 QTRAP型串联质谱，美国赛默飞公司；Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。
1.2 材料与试剂
天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、精氨酸（Arg）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、半胱氨酸（Cys）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro），批号5061-3330，规格1 nmol/μL，1 mL/支，标准品购自安捷伦公司；齐墩果酸（批号SO8030，规格20 mg，质量分数≥98%）、没食子酸（批号SG8040，规格20 mg，质量分数≥98%）、芦丁（批号SR8250，规格20 mg，质量分数≥98%）、D-无水葡萄糖（批号G8150，规格250 g，质量分数≥99.8%）对照品购自索莱宝生物科技有限公司；色谱级甲醇、乙醇、乙腈购自德国默克（Merck）公司；其余试剂均为国产分析纯。
滇黄精药材，3年生，采收于2022年10月，采自云南普洱，经云南农业大学农学与生物技术学院杨生超教授鉴定，为百合科黄精属植物滇黄精P. kingianum Coll. et Hemsl.的干燥根茎。
2 方法与结果
2.1 滇黄精炮制样品的制备
将滇黄精去杆，清洗干净晾干去皮，切至3 mm厚的薄片，用蒸汽蒸制4 h，最后放入鼓风干燥箱风干至含水量≤8%，得到滇黄精原料干片。
原料干片与黄酒5∶2混合后，需要待黄酒被吸收完全后，利用蒸汽蒸制4 h，焖润5 h，自然晾晒干燥至含水量≤15%即可，重复9次，新鲜样品编号S0，每蒸晒1次进行取样，编号S1～S9，得到“九蒸九晒”的炮制样品，备用。记录滇黄精炮制过程中外观变化。《食疗本草》[11]记载：“蒸之若生，则刺人咽喉。曝使干，不尔朽坏”。生黄精味干，咀嚼后舌根味麻，咽喉刺痛，几乎无甘甜味。九蒸九制后成品气味浓郁，入口甜酸味为主，略带苦味，无麻味，咽喉无刺激感，质地软糯有韧劲。
如图1所示，生滇黄精（S0）为黄白色，具有麻味，随着炮制次数的增加，样品颜色越来越深，在第3蒸（S3）之后颜色变化不明显，变成了黑褐色，第4蒸（S4）之后麻味消失，产生甜味，在第7蒸（S7）之后逐渐产生苦味和酸涩味。有研究表明，热处理可以改变样品的颜色并影响所得产物的质量[12]，这与美拉德反应有关。
图片
2.2 总多糖、总皂苷、总多酚、总黄酮和游离氨基酸的含量测定
2.2.1  总多糖  多糖具有控制血糖、抑制癌症等活性，是黄精重要的药效物质[13]。参考Su等[14]的苯酚-硫酸法并稍作改动，测定滇黄精中总多糖含量。精确称量0.1 g滇黄精干粉，置于圆底烧瓶中，加入30 mL 80%乙醇水溶液，沸水浴冷凝回流加热1 h。取出后滤过，去除滤液，留固体和滤纸一并塞回圆底烧瓶中，加入30 mL纯水，再次沸水浴冷凝回流加热1 h，滤过，取滤液，定容到50 mL，即为待测液。取待测液0.5 mL，加入1.5 mL纯水稀释4倍，配制为检测液。取2 mL检测液，按照上述方法进行检测。实验重复3次，计算总多糖含量。由表1可知，随着炮制次数的增加，总多糖质量分数显著降低（P＜0.05）。总多糖质量分数在S1后显著降低，S2～S8蒸制过程中，总多糖质量分数无明显波动，S9又显著减少。S0中总多糖质量分数为（198.39±17.96）mg/g，S9中总多糖质量分数为（66.31±25.12）mg/g，下降66.58%。结果与杨圣贤等[15]研究相比，总体质量分数变化趋势基本吻合，在前2次蒸制过程中多糖质量分数明显减少（P＜0.05），S2～S9中总多糖质量分数变化趋于稳定，在小范围内波动，且之间没有显著差异。
2.2.2  总皂苷  皂苷具有抗菌、抗肿瘤等药理活性，也是黄精中重要的活性物质，在药物和功能性食品中具有广阔的应用前景[16]。参考苑璐等[17]建立的香草醛-高氯酸-冰乙酸法，以齐墩果酸作为对照品，测定皂苷含量。精确称量1.0 g滇黄精干粉，置于锥形瓶中，加入30 mL 80%乙醇溶液，60 ℃水温，超声处理1 h。滤过，取滤液定容到50 mL，即为检测液。取检测液100 μL，挥干溶剂，按照上述方法进行检测，实验重复3次，计算含量。由表1可知，滇黄精皂苷质量分数在前2次蒸制过程中无显著性差异，在S3和S4蒸制时显著上升（P＜0.05），之后的蒸制过程中质量分数基本保持不变。S0中皂苷质量分数为（33.65±3.04）mg/g，S9中皂苷质量分数为（75.49±4.66）mg/g，增长2.24倍，其质量分数变化与杨圣贤等[15]的研究基本吻合。
2.2.3  总多酚  参考Xia等[18]建立的福林酚法，没食子酸作为对照品，测定总多酚含量。精确称量1.0 g滇黄精干粉，置于锥形瓶中，加入40 mL 60%乙醇水溶液，封口，50 ℃水浴加热提取2 h，滤过后定容至50 mL，摇匀后即为检测液。取检测液1 mL于25 mL棕色量瓶内，实验重复3次，计算含量。炮制过程中总多酚含量整体呈上升趋势，如表1所示。随着炮制次数的增加，多酚质量分数上升，在S5时明显增加（P＜0.05），在S7之后趋于稳定。S0中多酚质量分数为（2.98±0.49）mg/g，S9中质量分数为（8.45±0.47）mg/g，增加2.84倍，增加显著（P＜0.05）。
2.2.4  总黄酮  参考Jia等[19]建立的硝酸铝-亚硝酸钠法，以芦丁作为对照品，测定黄酮含量。称取1.0 g滇黄精干粉样品，加入40 mL甲醇和4 mL盐酸于圆底烧瓶85 ℃回流提取90 min，趁热滤过，冷却后用甲醇定容至50 mL，摇匀即为检测液。取检测液1 mL于25 mL棕色量瓶内，实验重复3次，计算含量。炮制过程中总黄酮含量整体呈上升趋势，结果如表1所示。其中第S1～S5次炮制缓慢上升，S6开始趋于平缓，在S9时达到最高。S0中黄酮质量分数为（8.19±0.30）mg/g，炮制结束后黄酮质量分数为（19.60±0.22）mg/g，增长2.39倍，增长显著。梁焕焕等[20]发现炮制过程中总黄酮含量整体呈上升趋势，其中S0～S2缓慢上升，S2～S4黄酮含量变化较大，之后趋于平缓，总体上升趋势与其研究基本相同。
图片
2.2.5  游离氨基酸  根据本实验室已报道的分析方法[21]，通过HPLC法测定制备样品中16种游离氨基酸的含量。检测结果如表2所示。氨基酸是重要的营养成分，作为一种药食同源的药材，氨基酸对于黄精的营养价值非常重要。从各组分含量变化趋势可以看出，前2次蒸制，各氨基酸组分变化不显著，其中Ala和Ser在第2次蒸制结束后，可能由于蛋白水解作用质量分数反增。从第3次蒸制开始，所有氨基酸组分质量分数逐渐减少，最后趋近于0。
图片
2.3  滇黄精炮制前后代谢物的比较
2.3.1  滇黄精代谢提取物采集与处理  收集炮制前无霉变原料干片15 g，标号FPK。炮制9次结束后无霉变干片15 g，标号PPK。进行冷冻干燥处理，参数设定为?55 ℃、0.12 MPa、12 h。冷冻干燥后研磨至粉末状。称取粉末50 mg，加入0.3 mL提取液，放在4 ℃冰箱中冷藏12 h，期间涡旋提取6次。之后在10 000 r/min，离心半径为10 cm的条件下离心溶液10 min，取上清液，过滤膜（孔径0.22 μm）保存，用于UPLC-MS/MS分析。
2.3.2 色谱质谱检测
（1）液相条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC HSS T3 C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为超纯水（加入0.04%乙酸，A）-乙腈（加入0.04%乙酸，B），洗脱梯度：初始5% B；0～10.00 min，5%～95% B；10.00～11.00 min，95% B；11.00～11.10 min，95%～5% B；11.10～14.00 min，5% B；体积流量0.35 mL/min；柱温40 ℃；进样量4 μL。
（2）质谱条件：电喷雾离子源（ESI+/?），温度550 ℃，质谱电压5 500 V，帘气（CUR）206.843 kPa（30 psi），碰撞诱导电离参数设置为高。在三重四级杆中，每个离子对是根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。
2.3.3 代谢物定性与定量分析  迈维代谢自建数据库MWDB（metware database），根据二级谱信息进行物质定性，分析时去除了同位素信号，含K+离子、Na+离子、NH4+离子的重复信号，以及本身是其他更大相对分子质量物质的碎片离子重复信号。代谢物定量是利用三重四级杆质谱的多反应监测（multi reaction monitoring，MRM）模式分析完成。该模式中，通过四级杆筛选目标物质的前体离子，排除干扰离子。诱导前体离子在碰撞室内碰撞和电离，形成碎片离子，再通过三重四级杆过滤筛选出所需要的一个特征碎片离子，排除其他离子的干扰，使定量结果更为可靠。获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正。
2.3.4 代谢物的检测与鉴定  从FPK和PPK中共鉴定出代谢物419个，如黄精素A、延龄草素、新西伯利亚黄精苷、阿魏酸、咖啡酰对香豆酰酒石酸、没食子酸等。从类别来看，共分为12类，这些代谢物主要为氨基酸及其衍生物66个，脂质65个，酚酸类52个，黄酮类51个，有机酸42个，生物碱41个，核苷酸及其衍生物32个，甾体9个，木脂素和香豆素7个，异黄酮1个，萜类3个，其他类物质50个。这些化合物被进一步分为28个亚类，包括黄烷醇、游离脂肪酸糖及醇类和甾体皂苷等（图2）。其中氨基酸及其衍生物的物质组成最为丰富，占总代谢产物组成的15.75%。此外，还检测到10种苯乙醇苷类化合物，如松果苷和毛蕊花苷，并将其归类于苯丙类化合物。
图片
梁泽华等[22]应用固相萃取结合超高效液相色谱-电喷雾四级杆飞行时间质谱联用技术（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time- of-flight mass spectrometry，UHPLC-Q-TOF-MS），共鉴定炮制前后黄精中的61个化学成分，Sharma等[23]通过超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器-电喷雾电离质谱法（ultra-high performance liquid chromatography-photodiode array detector electrospray ionization mass spectrometry，UHPLC- PDA-ESI/MS）在黄精根茎中鉴定了314种化合物，用这2种方法都鉴定了比本研究更少的代谢产物，说明本研究方法具有较高的识别鉴定效率。
为了更好地了解各炮制过程对滇黄精代谢产物的影响，2组样品的主成分分析（principal component analysis，PCA）得分图见图3，质量控制（quality control，QC）样品聚类在一起，PC1和PC2的总和为83.4%，表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。在该主成分中，FPK组和PPK组显著分离。这一结果表明，FPK和PPK组的代谢产物存在着显著差异。进一步利用变化倍数（fold change，FC）、特征变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）和P值来筛选差异代谢物，代谢物同时满足FC＞2或者FC＜0.5、VIP＞1、P＜0.05被认为是差异代谢物。结果表明在PPK与FPK的对比中，一共有209种差异代谢物。
图片
为了探究炮制前后各类差异代谢物的变化趋势，对差异代谢产物做了蜂群图分析。由图4可知，在PPK与FPK的比较组中，有112种代谢物相对含量增加（FC＞2，VIP＞1，P＜0.05），包括7个生物碱，10个氨基酸及其衍生物，5个黄酮，1个木脂素和香豆素，26个脂质，8个核苷酸及其衍生物，12个有机酸，20个酚酸，2个萜类和21个其他类；有97种代谢物相对含量降低（FC＜0.5，VIP＞1，P＜0.05），包括9个生物碱，26个氨基酸及其衍生物，9个黄酮，18个脂质，13个核苷酸及其衍生物，8个有机酸，10个酚酸和4个其他类。经过九蒸九晒之后，产生了48个新化合物，有35个化合物被降解。
图片
2.3.5 差异代谢物相对含量变化  从差异代谢产物中共鉴定到11个糖类化合物（表3），经过炮制，9种糖类物质的相对含量显著增加。通过筛选一共鉴定到36个氨基酸及其衍生物相对含量显著变化，其中4个升高，17个下降。相对含量增加的物质分别是3-羟基-3-甲基谷氨酸、5-氧化脯氨酸、O-乙酰丝氨酸和脯氨酸甜菜碱。减少的物质包括L-缬氨酸、L-高胱氨酸、L-正亮氨酸等。此外，炮制后氨基酸以二肽或者多肽的形式存在，其中9种氨基酸被降解，新产生6个多肽，包括5-氨基戊酸、N-乙酰天冬氨酸和N-苯乙酰甘氨酸等。被降解物质包括L-犬尿氨酸、N-甘氨酰-L-亮氨酸和L-组氨酸等。各物质具体信息见表3所示。
图片
图片
图片
L-缬氨酸、L-高胱氨酸、L-正亮氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸等为人体常见氨基酸，在炮制过程中，随着高温蒸制次数增加，氨基酸含量逐渐降低。同时发现被降解物质中，如苏氨酸、组氨酸等氨基酸种类丰富，检测结果与HPLC检测结果一致。此外，在新生成和被降解物质中，N-苯乙酰甘氨酸和己酰甘氨酸，甲氧基犬尿氨酸和L-犬尿氨酸之间推测存在转化关系，结构式如图5。
图片
分析发现，20个有机酸化合物中共有6个相对含量增加，6个相对含量减少。此外，有2个被降解，有6个新生成。新生成的化合物包括2-呋喃甲酸、2-甲基丁二酸和2-羟基丁酸等，被降解的化合物为5-羟基己酸和犬尿氨酸。各物质的具体信息见表3。
2-呋喃甲酸常以其衍生物的形式出现，即5-芳基-2-呋喃甲酸，该物质具有调节植物生长、抑菌等作用，常用于医药领域，而2-呋喃甲酸也被应用在农业和香料方面[24]，同时根据前人研究发现，该物质为美拉德反应的中间产物，推测滇黄精炮制过程发生了该反应，消耗可溶性糖和氨基酸，使得氨基酸含量大量减少，颜色逐渐变深。上述实验中发现，氨基酸含量在第3次蒸制后被消耗殆尽，而颜色变化从第四次蒸制开始，变化不明显，也可推测滇黄精炮制颜色变化与美拉德反应相关。
3 讨论
滇黄精经过九蒸九晒之后变得气味浓郁，入口以酸甜味为主，无麻舌感，咽喉无刺激味，质地变得软糯有韧劲。随着炮制的进行，样品发生美拉德反应[12]，颜色越来越深，第3次蒸晒之后颜色变化不明显，变成黑褐色。在九蒸九晒过程中，黄精中的还原糖与氨基化合物发生反应，生成棕色甚至黑色的大分子物质，导致黄精颜色变深[8]。在滇黄精九蒸九制过程中，多糖、氨基酸含量的下降也与美拉德反应有关，皂苷、黄酮和多酚含量呈上升趋势。
由于蒸制过程长时间处于高温状态，根据王倩等[25]研究可以推测加热导致结构不同的甾体皂苷发生转化作用，薯蓣皂苷转化为苷元和次级苷，从而使皂苷含量增加。此外，张洪坤等[26]和李瑞等[27]发现黄精皂苷变化在1次蒸制和生品中最高，推测是黄精品种和炮制方式所导致的差异。
有研究表明，多酚的结构决定了其稳定性，多酚结构多为2-连（或邻）基酚基苯并吡喃类衍生物，除间位外，其酚羟基多为邻位和连位，并不是单羟基酚。重复的高温蒸制处理可能促进了组织细胞的破碎和共价键的断裂，促进更多酚类物质的释放[28]。高温会导致某些内源酶失活，阻止了酚类物质进一步被氧化，因此多酚的含量在处理后增加[29]。
通过广泛靶向代谢组学技术从滇黄精炮制前后的样品中鉴定到419个代谢物，筛选得到112种化合物相对含量增加，97种化合物相对含量降低。炮制后小分子糖类物质相对含量增加，且多糖含量减少，导致滇黄精炮制后变甜。因为乳糖是新生成的糖，其甜度约为蔗糖的70%，主要用于制造婴儿食品和配制药物，例如制药片、药粉时用作稀释剂[30]。异麦芽酮糖是一种多功能的新型甜味剂，同时也是国际上公认安全的蔗糖替代品，在医药、食品等行业中具有广阔的应用前景[31]。乳糖，异麦芽酮糖，葡萄糖等单糖都可以充当甜味剂使用。炮制之后总多糖含量降低，这些单糖的相对含量增加，说明大分子糖转化成为了小分子的单糖[22]。此外，检测到部分糖苷相对含量减低，而新产生部分三萜皂苷化合物。推测总皂苷含量增加的原因是加热导致结构不同的甾体皂苷发生转化作用，部分薯蓣皂苷转化为苷元和次级苷，还可能因为新产生部分三萜皂苷，从而使皂苷含量增加。
有机酸相对含量增加导致炮制后期滇黄精产生酸味。酚酸是一类分子中具有羧基和羟基的芳香族化合物，酚酸类化合物是茶叶多酚类物质中的重要物质[32]。多酚类化合物主要呈现苦味和涩味，滇黄精经过炮制之后酚酸类物质相对含量显著增加，与分光光度法检测结果一致，此结果说明炮制后产生的苦涩味可能来自于酚酸类。氨基酸及其衍生物相对含量降低最明显，与HPLC检测结果一致。吴毅等[33]和王淳等[6]发现炮制过程滇黄精发生了美拉德反应，推测氨基酸含量的减少与美拉德反应有关。
滇黄精生品会刺激咽喉，有麻舌感，九蒸九晒可降低滇黄精的刺激性，增强其补益功效，然而目前对九蒸九晒炮制机制的研究尚不明确。本实验从化学和风味层面研究了九蒸九晒前后滇黄精的变化，并认为滇黄精炮制之后的“减毒”和“增效”作用可能是滇黄精九蒸九晒过程中化学成分的变化所引起的，在九蒸九晒炮制过程中大分子化合物分解成为易于人体吸收的小分子化合物。本研究系统阐述了滇黄精九蒸九晒炮制过程中化学成分的变化，为炮制滇黄精有效成分的筛选与质量评价提供参考，同时差异性成分的发现为研究滇黄精生熟饮片中差异性物质的分析提供新思路，对滇黄精的扩大开发利用有重要意义。