韭菜属于石蒜科葱属多年生宿根蔬菜，适应性强，抗寒耐热，在全国各地均有栽培，基本上一年四季均有供应^{[1, 2]}，韭菜既有很好的食用价值，又有很好的药用价值，深受广大消费者喜爱，是我国消费量较大的的一种蔬菜^[3]。然而通过分析国家食品安全风险评估结果发现，韭菜的农药残留合格率远低于蔬菜总体合格率，存在质量安全风险隐患^{[4, 5]}，超标项目主要为腐霉利，韭菜中腐霉利残留超标成为公众日渐关注的主要问题^{[6, 7]}，2018 年8月2日，山东省食品药品监督局公布五批次韭菜腐霉利超标，其中一批次超标338倍。同日，安徽省食品药品监督局也公布了三批次韭菜腐霉利超标，其中一批次超标13.55 倍。2019 年5月22日，河南省市场监管局发布了《关于 22 批次食品不合格情况的通告》，在 22 批次食品不合格中，7 批次韭菜腐霉利检出值超标^[8]。韭菜中腐霉利超标频繁曝光，造成消费者产生“毒韭菜”的认识^{[1, 9]}。我国2021年9月3日起实施的《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB 2763－2021）规定，杀菌剂腐霉利在韭菜中的最大残留限量是0.2 mg/kg。2023年2月底，最新发布的《食品安全国家标准食品中2，4-滴丁酸钠盐等112种农药最大残留限量》（GB 2763.1—2022）中，杀菌剂腐霉利在韭菜中的最大残留限量已调整为5 mg/kg。

腐霉利(procymidone)又名杀霉利、速克灵，化学成分为 N－( 3，5－二氯苯基) －1，2－二甲基环丙烷－1，2－二羰基亚胺^[3]。主要通过抑制菌体内甘油三酯的合成，对葡萄孢属和核盘菌属真菌有特效，兼具保护和治疗双重作用，低毒、廉价、高效且具有广谱杀菌性^[10]，可防治蔬菜、果树等植物的灰霉病、菌核病、黑星病等病害^[11]。而韭菜主要病害较多，有灰霉病、疫病、菌核病、软腐病等^{[11, 12]}，其中灰霉病是韭菜的常见重要病害，发病后期常造成大量叶片溃烂、植株死亡，严重影响韭菜生长^[2]。目前腐霉利仍是防治韭菜灰霉病的主要药物之一^{[6, 13]}。然而农药不合理的使用会导致蔬菜农药残留量超标，从而对消费者健康带来危害。

腐霉利毒性虽然较低，日常接触不会使人或者动物发生急性中毒以及皮肤、黏膜损伤，但腐霉利可以在蔬菜和土壤中蓄积，其大量使用以及环境残留所体现出对环境内分泌干扰活性^[14]，在体内或体外都表现出抗雄激素特性，可以阻止雄激素与雄激素受体结合，进而抑制雄激素调控基因的表达，造成生殖器官的异常发育，如生殖器发育滞后、畸形或肿瘤等^[15]。长期暴露可能对人体生殖系统产生不良影响。美国环境保护署（Environmental Protection Agency，EPA）认为腐霉利能引发人体雄激素依赖组织发生组织学变化，或对其他类似内分泌系统产生负面影响^[8]。

目前，腐霉利检测方法常见的有气相色谱法（GC）、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）^[16]、液相色谱法（LC）^[17]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）^[18]等。其中 GC-MS/MS 法具有灵敏、快速和准确等优点，但前处理多采用固相萃取方法，操作繁琐且需要大量的有机试剂。LC-MS/MS法，目前文献报道较少，《食品污染物检测方法手册》植物性样品中农药多组分残留采用LC-MS/MS法，方法处理简单，但该方法是同时测定植物性样品中19种农药残留，方法的设定要兼顾不同植物性样品的基质和19种农药的特性，处理方法和仪器条件对于韭菜中腐霉利并不是最优选择，而且韭菜是一种复杂基质，其中的蒜氨酸水解会产生一系列含有不同取代基的硫化物，对检测结果会产生较强干扰，在农残检测中属于分析难度较大的基质^[16]。对于新鲜韭菜，常采用微波消解先消除巯基的干扰^{[16, 17]}。韭菜的腐霉利超标问题备受社会各界关注，严重影响了群众消费韭菜的信心，故急需建立针对韭菜中腐霉利的检测方法，开展韭菜中腐霉利的专项检测，本研究在《食品污染物检测方法手册》中LC-MS/MS法的基础上，针对韭菜特殊基质，优化了前处理条件，根据腐霉利在韭菜基质的干扰情况，优化了色谱和质谱条件，顺利建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定韭菜中腐霉利农药残留的检测方法，方法简单快速，灵敏准确，特异性强，应用该方法对本市售韭菜开展专项定量检测，初步掌握了我市韭菜中腐霉利农药的残留污染水平，运用农产品中农药残留最大限量(MRL)评判其超标情况，为腐霉利的安全使用、监督、检测提供参考，为评估韭菜质量安全状况、指导农户在韭菜病虫害防治过程中科学使用农药及相关部门对农产品质量监管提供科学依据，进一步保障了消费者的食品健康和安全。

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1样品来源

按照专项监测计划要求并根据本市居民的饮食消费情况，2023年在本市采集流通环节市售韭菜样品共20份。

2.1.2主要仪器与试剂

高效液相色谱串联质谱仪（美国Waters Xevo TQ-S ）；电子天平（感量0.001 g赛多利斯BT-223S）；多管涡旋混合仪（上海月旭B100250）；GM200刀式研磨仪（德国莱驰科技公司）；乙腈（德国默克公司色谱纯）；氯化钠（麦克林分析纯）；C₁₈粉末、PSA粉末、GCB粉末（上海月旭　40-60μm）；标准溶液：腐霉利（100 μg/mL，北京美正公司)；尼龙滤膜( 0. 22 μm，美国 Millipore)；水为符合GB/T 6682规定的一级水。

2.2方法

2.2.1标准溶液的配制

取腐霉利标准溶液，用乙腈逐步稀释，配制成浓度为 1 μg/mL的标准使用液。取适量腐霉利标准使用液至10 mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液稀释至刻度，标准系列溶液浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100、200 ng/mL。

2.2.2样品处理

取鲜韭菜样品500 g以上，将韭菜样品表面的泥土擦拭干净，切断，用刀式研磨仪粉碎混匀，准确称2 g样品置于50mL离心管中，加入1 g氯化钠，再加入30 mL0.1%甲酸乙腈，涡旋振荡提取20min后10 000 r/min 低温（<4 ℃）离心 10 min。上清液转出待净化。

取前述上清液 2 mL移入预先称好的含20 mg GCB、20 mg C₁₈和50 mg PSA的2 mL 净化管中，涡旋震荡 5 min，10000 r/min 离心 5 min，取上清液1mL加入1mL水后混匀，过0.22 μm尼龙滤膜后测定。

2.2.3仪器条件

色谱条件：色谱柱：HSS T3 柱（1.7 μm，2.1×100 mm）；柱温：40 ℃；样品室温度：15 ℃；进样量：5μL，流动相：A：乙腈；B：0.1%甲酸水溶液，流速：0.25 mL/min；梯度洗脱程序见表1。

表1 腐霉利梯度洗脱程序

时间（min）	A（%）	B（%）
0	30	70
1.5	30	70
6	85	15
8	85	15
9	30	70
10	30	70

质谱条件：电离源：电喷雾离子源，ESI+；毛细管电压：3.4KV；离子源温度：150 ℃。脱溶剂气温度：400 ℃；脱溶剂气流量：700L/H；锥孔反吹气流量：150L/h；检测方式：多反应监测MRM。目标物质谱参数见表2。

表2 腐霉利的主要参考质谱参数

化合物名称

母离子

（m/z）

子离子

（m/z）

碰撞能量

（eV）

锥孔电压

（V）

保留时间（min）

腐霉利

284.1

256.0*/95.1/67.1

16/20/28

5.42

注：*为定量离子

3 结果

3.1 提取条件优化

选用乙腈、0.1%甲酸乙腈、甲醇、0.1%甲酸甲醇4种常用提取试剂，考察不同提取试剂对阴性加标样品（0.10 mg/kg）的提取效率，对回收率进行比较，结果发现：采用0.1%甲酸乙腈时回收率最高在90.3%~94.4%之间，其次0.1%甲酸甲醇（82.4%~84.5%）、乙腈（80.4%~81.9%）和甲醇（72.4%~80.9%），故选择0.1%甲酸乙腈溶液作为韭菜中腐霉利的提取溶剂。分别考察不同体积（15、20、25、30、35 mL）0.1%甲酸乙腈对测定效果的影响，结果发现15、20 mL时提取液呈现深绿色，色素提取较多净化后依然存在较为明显的绿色，使用25、30、35 mL提取试剂时，提取液颜色明显变浅，对不同体积时的提取液上机进行测定，发现使用15、20、25 mL测定结果偏低，存在较为严重的基质效应使用30、35 mL提取液测定结果理想，考虑到韭菜中腐霉利限量和标准曲线线性范围，选择30 mL提取体积，更加适合对超标样品的测定。

3.2 净化试剂的优化

QuECHERS前处理法常用的净化剂有N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、十八烷基硅烷化键合硅胶（C₁₈）。实验发现，韭菜色素含量较高，仅靠C₁₈和PSA净化色素残留量依然严重，影响检测。GCB 吸附色素能力强，能有效去除韭菜中的色素，添加GCB，色素残留明显降低，但超过20 mg时会降低腐霉利回收率。通过优化三种粉末不同配比对回收率的影响，最终确定20 mg GCB、20 mg C₁₈和50mgPSA 净化2mL提取液时效果最佳。

3.3 色谱条件优化

选择甲醇-水溶液，乙腈-水溶液，甲醇-0.1%甲酸水溶液，乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相进行比较，结果表明，不同的流动相对腐霉利的出峰时间和响应有较大的影响。当选择 0.1%甲酸作为水相，乙腈为有机相时，目标化合物的响应较好，且峰型对称，无拖尾伸舌等现象，流动相中加入了甲酸后，能促进腐霉利的离子化过程。且有机相选取乙腈时，柱压比用甲醇时明显降低。所以最终选取乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相，并采取梯度洗脱程序，有利于韭菜基质中非极性物质的流出完全。

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图1 流动相乙腈-0.1%甲酸水时腐霉利TIC图

3.4 质谱条件优化

配制50 ng/mL的标准溶液，在正离子模式下，优化确定最佳毛细管电压、脱溶剂气温度和流量等参数，使用仪器智能方法开发程序，进一步确定腐霉利的定量离子对和定性离子及对应的锥孔电压、碰撞能量等质谱参数见表2，建立多反应监测（MRM）采集模式，腐霉利总离子流图及二级质谱图见图2。

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图2 腐霉利总离子流图及二级质谱图

*（从上至下依次为总离子流、284.1/95.1、284.1/256.0、284.1/67.1）

3.5基质效应考察

配制腐霉利空白基质加标溶液，同时配制相应的溶剂标准溶液，在优化后的仪器条件下，测定待测物在基质中的响应与在纯溶剂中的响应比值评价基质效应（n=3），腐霉利平均基质效应为78.3～87.2%，存在一定的基质抑制效应，为准确定量韭菜中腐霉利含量，本实验使用基质匹配曲线，保证了方法的准确度。

3.6 线性范围和检出限、定量限

在2.2.3的仪器条件下，配制腐霉利基质标准溶液系列，经 LC-MS/MS 测定后，以化合物的峰面积和浓度做图，绘制标准曲线。腐霉利在5.0 μg/L~200 μg/L质量浓度范围内线性关系良好，回归方程、相关系数 r，见表3。

选取阴性韭菜样品，加入适量标液，以信噪比（S/N）为3和10时色谱响应值对应的加标量为检出限(LOD)和定量限(LOQ)。结果见表3。

表3 腐霉利的回归方程、相关系数、检出限和定量限

目标物	回归方程	相关系数r	检出限（mg/kg）	定量限（mg/kg）
腐霉利	Y=6966.2X+1892.5	0.9991	0.003	0.010

3.7精密度和准确度

选取韭菜空白样，加入不同浓度水平的腐霉利标准溶液，配制成低中高三个浓度水平的加标样品，每个加标样品进行6次平行试验，加标浓度、回收率以及相对标准偏差(RSD)见表4。加标回收率在92.2%～105.5%之间，RSD为3.4%～4.4%。

表4 腐霉利的回收率和精密度实验（n=6）

化合物名称	加标水平（mg/kg）	测定均值（mg/kg）	回收率（%)	RSD(%)
	0.010	0.0096	96.0	3.4
腐霉利	1.000	0.922	92.2	4.4
	5.000	5.275	105.5	4.2

3.8 方法应用

采用优化后的方法对20份韭菜样品进行检测，腐霉利检出17份，检出率为85.0%，含量范围为：<0.003~5.11 mg/kg，平均值为0.59 mg/kg（未检出的样品以方法检出限的1/2参与统计），参照我国于2021年9月3日实施的《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB 2763－2021）中腐霉利在韭菜中的最大残留限量0.2 mg/kg，超标率为60.0%（13/20）。按照于2023年5月11日起实施的《食品安全国家标准食品中2，4-滴丁酸钠盐等112种农药最大残留限量》（GB 2763.1—2022）中腐霉利在韭菜中的最大残留5 mg/kg统计超标率，超标率为5.0%（1/20）。

4 讨论

韭菜是含硫蔬菜，在被切碎时活性酶会促使韭菜释放出硫化物，产生特殊气体，硫化物在前处理过程中很难去除，常见的处理方法有微波加热处理、冷冻处理等，其分子量与大部分的农药接近，在进行色谱分析时造成很大的干扰^[16]，所以韭菜中腐霉利的提取选择了0.1%甲酸乙腈，利用了乙腈较宽的极性和组织穿透能力，以及对腐霉利较好的溶解性，在氯化钠的参与下使乙腈与水层较好的分离，同时使用甲酸增强腐霉利的电离能力，提高了腐霉利的质谱响应。

韭菜基质比较复杂，富含糖、粗蛋白、粗脂肪、膳食纤维、维生素、钙、镁、锌、硒等成分，其中色素含量高，PSA 能够除去部分脂溶性色素、糖类、脂肪酸等，C₁₈可以吸附非极性物质、脂肪以及色素，但C₁₈和PSA对韭菜中色素净化效果较差，干扰测定结果的准确性^[12,18]。GCB能有效去除韭菜中的色素，但过多的GCB对平面结构和对称结构的物质有吸附作用，故需要优化混合净化粉末配比，方能有效去除韭菜基质中干扰成分对测定腐霉利的影响，降低基质效应，提高了回收率。

选取乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相，采用梯度洗脱程序，可有效减少分析物和基质组分的共洗脱，当使用纯水为水相时，腐霉利峰形分裂，响应也会降低，所以流动相中添加甲酸对于韭菜中腐霉利的测定极为重要。

韭菜中的腐霉利虽然检出较为常见，但韭菜基质复杂，以及不规范联合用药情况，导致韭菜中腐霉利的检测依然会存在假阳性，本研究采用284.1/256.0作为定量离子采用284.1/95.1，284.1/67.1两个子离作为定性离子，有利于排除假阳性。

本研究通过优化提取和前处理条件，同时优化色谱条件，将腐霉利在韭菜样品中的基质效应进一步降低，但仍存在一定基质抑制效应，腐霉利在韭菜中检出率较高，如不准确测定，会影响对超标样品的评判，进而无法准确评估韭菜中腐霉利的安全状况，故本研究采用基质标准曲线，保证测定的准确度。

实际样品测定，韭菜中腐霉利检出率为85.0%，超标率为 5.0%。说明腐霉利在韭菜种植过程中使用较为普遍，并且存在乱用、滥用导致腐霉利超标的现象，应引起警示，我国农药残留标准中已经制定了韭菜中腐霉利残留的最高限量，虽然新标准中韭菜中的最大残留限量已调整为5mg/kg，但本次检测依然检出超标样品，应当继续加强韭菜中腐霉利长期、专项检测，并通过相关部门加强监管，保护人们群众健康。

5 结论

本文建立的QuECHERS净化超高效液相色谱-串联质谱测定韭菜中腐霉利农药残留的检测方法，精确匹配韭菜的特殊基质和韭菜中腐霉利残留特点，结合相关文献，优选的提取溶剂和净化方法，对韭菜中腐霉利的提取和净化具有专一性，避免了其他多残留方法为兼顾多组分中其他农药，牺牲腐霉利回收率和灵敏度的做法，经过方法学验证，确认方法的线性范围和检出限，能够满足韭菜中腐霉利微残留和超标判定的检测需求，具有前处理耗时短、准确性好、灵敏度高的优点，适用于韭菜中腐霉利农药残留的定性及定量分析，为韭菜中腐霉利农药残留的UPLC-MS/MS 分析提供了方法参考。应用本方法对本市20份韭菜样品进行了专项测定，对结果进行了统计分析，为食品安全提供了准确数据，较好完成了检测任务。

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