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液相色谱（LC）
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主题：【分享】离子交换色谱

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发表于：2024/09/08 20:13:59 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
离子交换色谱是一种利用物质之间离子相互作用差异进行分离和纯化的方法，是利用离子交换剂，也就是固定相上的可交换离子与流动相中各种带电荷离子间的电荷作用力不同，经过交换平衡达到分离目的的一种柱色谱法。

离子交换又分为阴离子交换层析和阳离子交换层析。                                                                                                                                                                                                                                                                  阴离子交换色谱法是带负电的分子被带正电的固定相载体所吸附，通常是带正电的树脂，比如季铵盐树脂；阳离子交换色谱法是带正电的分子被带负电的固定相载体所吸附，通常是提供负电荷的树脂，比如磺酸基树脂。离子交换色谱法常用于蛋白质的分离纯化，该方法的操作主要分为四个步骤，润柱(平衡)、上样、淋洗、洗脱。

第一步是将固定相平衡到所需的起始条件，样品缓冲液的pH值和离子强度的选择是为了保证样品上样时，目标蛋白与固定相结合，并且尽可能使杂质不结合。

第二步是样品上样，目标蛋白可以通过环境的pH值带上正电荷、带负电荷或不带电，这个净电荷可以通过比较每种蛋白的等电点与缓冲液的pH值来确定，蛋白是一条或多条氨基酸残基长链组成的生物大分子，由于氨基酸结构上有氨基和羧基，氨基可以被质子化带正电荷，羧基可以去质子化带负电荷，所以蛋白质可以是带正电荷、带负电荷或者不带电。等电点是蛋白质不带电时的pH值，当pH低于等电点时，蛋白带正电，高于等电点时，带负电。                                                                                                                                                                                                                                                例如，蛋白A等电点是3，蛋白B等电点是5，蛋白C等电点是9，缓冲液pH值是7，因此，蛋白质C净电荷为正，而蛋白A和B净电荷都为负，另外，蛋白A的等电点比蛋白B的低，所以A的负电荷更多。

如果我们用阴离子交换，带负电荷的蛋白会与固定相表面的正电荷结合，不带电荷的蛋白和带正电的蛋白不会结合，它们直接流出色谱柱。

第三步是淋洗，用起始条件的缓冲液来清洗柱子，确保所有非结合的蛋白或杂质都通过了色谱柱。

第四步是改变条件洗脱结合的蛋白，常见的方法是通过增加缓冲液的离子强度，有时也会通过改变pH值来洗脱。随着离子强度的增加，盐离子与被结合的组分在介质表面争夺电荷，这时结合的组分开始被逐个洗脱，在选定pH值下，具有最低净电荷的蛋白质会随着离子强度的增加首先从色谱柱上洗脱下来，同时，带有较高电荷的蛋白还在被牢牢挂住，并在随着离子强度增加，最后被洗脱。蛋白B具有较低净正电荷，所以它可以被先洗脱，其次是净电荷最高的蛋白A。                                                                                                                                                                                                                                                            改变缓冲液pH值也可用于分离和洗脱结合的蛋白质，如蛋白A的等电点等于3，蛋白B的等于5，所以，如果我们调整洗脱剂的pH高于蛋白A等电点，低于蛋白B的等电点，蛋白B会带正电先被洗脱，蛋白A仍然带负电，仍保留，接下来，再降低洗脱剂pH值低于A的等电点，蛋白A就被洗脱下来。

离子交换色谱的分离过程只涉及一种相互作用，不确定性低，分离结果基本都在意料之中，控制离子强度或者缓冲液pH的变化，蛋白质即被分离纯化。
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