主题：【分享】高效液相色谱方法开发篇|关于方法建立的不同策略汇总小知识

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发表于：2024/10/17 09:12:21 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

今天对之前讲了几个不同模式的分析方法开发做一个小小的汇总，高效液相色谱方法的开发是一个繁复的过程，但不管再繁复，也有其规律可寻。方法开发过程中，一个总的原则是：先找到目标化合物的峰，然后调整峰形，再是进一步完善。

01.样品特性的了解

在方法建立之初，应该对样品的化学组成有一定的掌握。如果样品中有酸性或碱性的化合物，可能需要在流动相中加入缓冲液来控制pH。样品化合物的pKa值，如果已知，对方法建立非常有帮助。样品的分子量也可能影响起始实验分离条件的选择。如果在文献中发现类似的方法，可以借鉴并改良。如果产品与自家的其他产品类似，可先采用自家的平台方法进行摸索。

如果样品比较杂，需评估是否需要对样品做一些预处理，以去除那些可能会损害柱子或干扰目标的化合物成分。这包括样品溶解、样品净化、样品浓缩、样品提取、样品衍生化、样品过滤和样品pH调节。

02.分析方法开发模式的选择

反相色谱法一般是HPLC方法建立的一个默认选择，但其他色谱模式如正相色谱法(NPC)、亲水色谱(HILIC)、离子交换色谱(IEC)和体积排阻色谱(SEC)可能更适合某些样品。选择色谱模式时，需要考虑样品的化学和物理特性。
1）反相色谱（RPC）：
a. 机理：基于分析物在疏水固定相和极性流动相之间的分配差异。固定相通常是C18或C8等烷基键合硅胶，流动相为甲醇、乙腈或含水相的缓冲液。b. 适用性：适用于分离非极性、极性或离子型化合物，是目前应用最广泛的色谱模式，特别适合分析小分子化合物。
c. 特点：分辨率高、平衡速度快，可改变流动相的组成和pH值来优化分离。
d. 注意事项：对于可离子化化合物，可添加离子对试剂的方式进行分析。
2）正相色谱（NPC）：
a. 机理：基于分析物在极性固定相上的吸附/解吸附过程。固定相通常是硅胶或氧化铝，流动相为非极性和弱极性溶剂，如正己烷、二氯甲烷等。
b. 适用性：适用于非极性与弱极性化合物的分离，如脂溶性维生素、甾体激素等。
c. 特点：在极性填料表面可能产生死吸附，导致重现性较差。
3）亲水色谱（HILIC）：
a. 机理：基于分析物在流动相与固定相表面富水层之间的分配差异。固定相为极性基团键合填料，流动相为含水的有机溶剂。
b. 适用性：特别适合极性化合物的分离，如糖、极性代谢物等。
c. 特点：有时被称为含水正相色谱，是高极性化合物分析的重要手段。
4）离子交换色谱（IEC）：
a. 机理：基于分析物所带电荷与离子交换剂上带相反电荷的基团之间的相互作用。
b. 适用性：适用于离子化化合物的分离，如氨基酸、蛋白质等。
c. 特点：离子交换剂可以是阴离子或阳离子交换剂，通过改变pH或离子强度实现分离。
5）体积排阻色谱（SEC）：
a. 机理：基于不同分子量组分在填料内的流经路径差异，实现分离。
b. 适用性：适用于大分子化合物的分子量测定和分布分析，如聚合物、蛋白质等。
c. 特点：通常不适用于小分子之间的分离，因为分辨率较低。
03.流动相的选择流动相的选择因素包括极性、pH、粘度和添加剂。根据样品的极性选择合适的溶剂或溶剂组合，调节流动相的pH值以适应样品组分的性质，选择低粘度流动相以利于分离，并在流动相中加入缓冲液或其他添加剂以增强分离效果。
1）反相色谱：最常用的液相色谱模式，固定相通常是非极性的，而流动相多为水和有机溶剂的混合物。常用流动相溶剂包括水、甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）。常用添加剂包括磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、甲酸或乙酸和三氟乙酸（TFA）。
2）正相色谱：多用于分离极性样品，固定相极性较高，流动相则使用非极性或弱极性溶剂。常用流动相溶剂包括己烷/异辛烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和氯仿。添加剂包括异丙醇和酸碱调节剂。
3）离子交换色谱：通过离子交换基团的作用分离离子型样品。常用流动相溶剂与缓冲液包括磷酸盐、醋酸盐、硼酸盐等。有机溶剂如甲醇和乙腈可与缓冲液混合以增强洗脱能力。添加剂包括酸碱调节剂和离子对试剂。
4）尺寸排阻色谱：主要用于分离大分子物质，如蛋白质、多糖等。常用流动相溶剂包括水相缓冲液和有机溶剂。添加剂包括防腐剂和pH调节剂。

03.色谱柱的选择

1）孔径选择：对于分子量小于5000的小分子化合物，通常选择小孔径（60-100?）填料柱，以便样品分子能够进入填料孔中，实现良好的分离；对于大分子如蛋白质和多肽，应选择孔径较大的填料柱（如300?），以避免分子尺寸过大而无法进入孔径较小的填料孔中，导致分离效果不佳。

2）粒径选择：标准HPLC柱的粒径为5μm，适用于大多数常规分析。

对于需要快速分析或更高分离度的应用，可以选择更小粒径的填料，如3.5μm或1.8μm，以提高柱效和分离度。

3）长度选择：色谱柱的长度和内径也会影响分离效果。常见的配置有4.6mm内径的柱，长度从50mm到250mm不等，适用于不同的分析需求；较短的色谱柱（如50mm或75mm）适用于快速分析，而较长的色谱柱（如150mm或250mm）则适用于需要更高分离度的应用。

注：如果可以的话，大家也可以上USP的官网查查色谱柱的相关信息，美国药典（USP）对色谱柱有特定的分类和要求，如L1、L3、L7等，这些分类基于填料的化学和物理特性。

04.检测器的选择

检测器的选择取决于样品的特性、分析目标以及所需的灵敏度和选择性。常用的HPLC检测器包括紫外-可见光（UV）检测器、荧光检测器（FD）、示差折光检测器（RID）和蒸发光散射检测器（ELSD），这里就不额外细说了。

05.分离条件的选择

在知道样品的特性、色谱模式、流动相的选择、色谱柱的选择以及检测器的确定后，可以对方法进行初步分离筛选。这包括梯度的优化、流速、柱温和样品上样量。
1）梯度的优化：确定合适的起始和终止有机溶剂浓度、梯度时间以及流速，通过初步的梯度侦测实验评估分离效果，然后根据需要调整梯度范围和条件以优化分离。这个过程需要考虑色谱柱的特性、样品的复杂性以及仪器的延迟体积，以确保有效的分离和缩短分析时间。
2）流速的优化：流速通常根据色谱柱的耐受压力和分析需求确定。如果目标物与杂质分离较远，可以在压力允许的条件下，增加流速，缩短分析时间。
3）柱温的优化：柱温的选择会影响分离速度和柱压，一般设定在室温至35℃之间。另：我们还考虑样品的溶解性和稳定性以及确定合适的上样量是比较重要的，因为这直接影响色谱分离的效果和分析结果的准确性。样品需要在流动相中充分溶解以避免柱堵塞，其稳定性在不同储存条件下会影响结果的可靠性，而上样量则决定了检测的灵敏度和重复性。

总计一下：

高效液相色谱（HPLC）方法的开发是一个复杂的过程，但只要掌握了基本步骤，就能顺利进行，期间的反复折腾是在所难免的。

首先，了解样品的特性是关键，比如它的化学组成、分子量和pKa值，这些信息能帮助你选择合适的色谱模式，比如反相、正相、亲水、离子交换或体积排阻等。接着，选择合适的流动相和色谱柱，调整流动相的组成和pH值，以及色谱柱的孔径、粒径和长度，来优化分离条件。检测器的选择也很关键，它取决于样品的特性和分析需求。最后，别忘了考虑样品的溶解性和稳定性，以及上样量，这些因素都会影响分离效果和分析结果的准确性。

总之，HPLC方法开发就是一个从了解样品开始，逐步调整和优化，直到找到最佳分离条件的过程。

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