食品中对羟基苯甲酸酯类液相与气相色谱法的测定方法比较

摘要：本文详细讲述了液相色谱与气相色谱法测定食品中对羟基苯甲酸酯类各自的优缺点，GB 5009.31-2016只收录了气相色谱法测定标准的测定方法。

关键词：对羟基苯甲酸酯类；液相色谱；气相色谱；优缺点；GB 5009.31-2016

引言食品中常见的对羟基苯甲酸酯类又称为对羟基安息香酸酯或尼泊尔金酯，包括对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯，是一类新一代高效低毒消毒杀菌防腐剂，它的抗菌能力、pH应用范围及用量比苯甲酸和山梨酸及其盐类广（见表1），且使用安全，经济方便，对人体刺激较小。在国外，已被广泛用于食品、饮料、化妆品和医药等方面。作为食品防腐剂，它可用于饮料、果蔬加工品、海产加工品、禽畜加工品、调味品、啤酒、米酒等加工品中，还可用于水果、蔬菜和海产品的防腐保鲜。它不但可完全替代苯甲酸钠和山梨酸钾，其使用范围比苯甲酸钠和山梨酸钾更广。在国外，已被广泛用于食品、饮料、化妆品和医药等方面。在日本，对羟基苯甲酸酯和山梨酸是主要的防腐剂产品。而我国，对羟基苯甲酸酯类防腐剂的用量也在逐年增加，成为防腐剂的第二个主要产品。

表1 GB2760-2014对羟基苯甲酸酯类限量要求

实验部分讨论

液相色谱

1.前处理及色谱分析条件

称取5g（精确至0.01g）试样于50ml比色管中，加入15mL95%乙醇，混匀，超声波清洗器提取10min，冷却至室温后用95%乙醇定容至50mL刻度线，摇匀。静置分层，取上清液经0.22um微孔滤膜过滤后待测。色谱柱：C18柱，150×4.6 mm（i.d），5 μm，或性能相当者；

流动相：甲醇（B）+20 mmol/L乙酸铵溶液（A） = 40+60（体积比）；

洗脱梯度见表2：

表2. 对羟基苯甲酸酯类的洗脱程序

时间/min	2.00	4.00	12.00	12.01	15.00
B%	40	60	60	40	stop

流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样体积：10 μL；检测波长扫描范围：210 nm—390 nm，定量波长256 nm。

由于对羟基苯甲酸酯在pH4~8的范围内稳定存在且有很好的抗菌效果，但水溶性较低，易溶于乙醇，而乙醇的毒性较甲醇低，所以采用乙醇做为标准使用液和样品提取液。大部分添加对羟基苯甲酸酯类的食品都具有含水性高、不易长期保存的特点，因此在取样时选择被测物稳定保存的状态，采用浸泡过夜、超声及振荡提取的方式，能达到较好的提取效果。

2、色谱条件的选择及优化

2.1 检测波长的选择

以浓度为0.02 mg/ml的标准使用液依次在高效液相色谱—二极管阵列检测器190 nm-410 nm波长范围进行扫描，以确定被测物质的最大吸收波长，对羟基苯甲酸酯类的最大吸收波长均十分相似，在256nm处有紫外最大吸收峰，这是与自身具有苯环和羰基结构所决定，实验选择256nm为检测波长，能有效满足四种物质的分析检测。

2.2 分析条件的选择

分别使用水和20mM乙酸铵做流动相在相同色谱条件下进行分析（见图2），UPLC（超高速液相）在5分钟内完全分离且重现性好，出峰顺序依次为对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯。由图可以看出在峰形和分析时间上利用缓冲盐做流动相要优于纯水，特别是面对食品样品的复杂性，选择20mM乙酸铵和甲醇作为流动相能有效排除基质干扰。

图2 混合标准样品色谱图

1.对羟基苯甲酸甲酯；2.对羟基苯甲酸乙酯；3.对羟基苯甲酸丙酯；4.对羟基苯甲酸丁酯

实验选择C18色谱柱进行分离，是根据尼泊尔金酯类的物理化学性质，在C18柱上具有良好的保留，当提高有机相甲醇的比例时，能快速得到洗脱。选择20m M乙酸铵作为流动相，能较好的平衡食品复杂基质的p H值，有效避免杂质干扰。实验尝试使用了日本岛津HPLC-20A，美国Grance Alltima 4.6mm×150mm C18色谱柱与日本岛津UPLC，shim-pack XR-ODS 3.0mm×75mm C18色谱柱对市售果蔬汁饮料、酱腌菜及酱油制品和糕点等所含的对羟基苯甲酸酯类进行比对分析，发现均能得到良好分离，且结果一致。在实验中发现，相同条件下，采用HPLC-20A，美国Grance Alltima 4.6mm×150mm C18色谱柱对酱腌菜类食品进行分析，在对羟基苯甲酸乙酯处会有干扰（见图3），通常情况下，改变流动相的比例能避免此类问题的发生，但若直接选用岛津UPLC，shim-pack XR-ODS 3.0 mm×75 mm C18色谱柱进行分析，则能有效避免（见图4）。考虑到两种C18柱的价格及维护费用，选择使用Grance Alltima 4.6mm×150mm C18进行大批量的实验分析，在保证实验数据的准确可靠前提下，能有效降低成本。

图3 酱腌菜中对羟基苯甲酸酯类色谱图（HPLC-20A）峰序同图2 图4 酱腌菜中对羟基苯甲酸酯类色谱图（UPLC）

2.3 基质的干扰与条件优化

实验选择糕点、果蔬汁饮料及酱油及酱腌菜类为基质，采用上述方法进行前处理，岛津HPLC-20A，Grance Alltima 4.6mm×150mm C18进行分析检测，发现果蔬汁及饮料等，基质简单，峰形对称（见图5）；在进行酿造酱油基质的加标回收分析时发现，甲酯由于出峰时间较早，容易被杂质峰包埋，致使检测的检出限降低（见图6）；酱腌菜类食品由于基质复杂，特别是在腌制过程中产生的不明物质较多且各有差异，在实验中稍有不慎，极容易与对羟基苯甲酸乙酯、丙酯产生干扰（见图7），因此在进行分析过程中应注意色谱条件的选择，改变流动相中甲醇的比例能有效避免杂质的干扰。

气相色谱

国标GB5009.31-2016《食品安全国家标准对羟基苯甲酸酯类的测定》检测范围为酱油、醋、饮料及果酱，采用GC酸化提取后进行分析检测，实验原理与本方法可互为验证和补充，但操作步骤复杂，耗时长，乙醚试剂消耗大，对检测人员伤害较大，且效率低，但基质处理的干净，不存在干扰而产生假阳性的情况。

仪器条件：

Agilent 7890 检测器：FID 进样量：1 μL 色谱柱：HP-1（30m*320μm*0.25μm）；HP-5（30m*320μm*0.25μm）；DB-17 30m*320μm*0.25μm ； HP-5MS（30m*320μm*0.25μm）检测器温度：240℃ 进样温度：250℃

程序升温：100℃（1min） 20 ℃/min 160℃（3min） 15 ℃/min 250℃（3min）

样品处理：取样5.0 g（±0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入1 mL盐酸（1：1）溶液酸化，再加入10 mL饱和氯化钠水溶液摇匀，分别每次30 mL乙醚提取三次，涡旋振荡4000 r/min离心，取上清液乙醚合并入250 mL分液漏斗中，先加入10 mL饱和氯化钠水溶液洗涤一次弃去水层，分别每次30 mL 1g/100mL的碳酸氢钠溶液洗涤洗三次，静置，弃去水层。过装有10 g无水硫酸钠的漏斗至鸡心瓶中，35℃浓缩至干，用无水乙醇定容至2 mL上机测试。

注释：

（1）使用HP-5MS色谱柱主要是为了增加分离度，使得目标峰与分析纯乙醚中的干扰峰分离开。

（2）对羟基苯甲酸乙酯处有试剂干扰，来自乙醚。

（3）标准中使用125 mL的分液漏斗，实验室直接使用50mL的塑料离心管更易于提取。

（4）标准中用75 mL、50 mL、50 mL乙醚提取三次，实验室用离心管离心取上层乙醚层更方便，由于离心管容积只有50 mL，所以减少乙醚量，分别每次用20 mL乙醚提取三次。

（5）标准中用分液漏斗萃取，静置弃去水层，实验室用离心的方法分层，取上清液乙醚层。

（6）标准中在分液漏斗中加10 g无水硫酸钠于室温放置30 min脱水，实验室过装有10 g无水硫酸钠的漏斗脱水。

色谱图分析比较：通过图8、图9（气相法前处理）与图5～图7（液相法前处理）比较，气相的图谱明显干净多了，而且不存在一点的基质干扰的现象。

果酱食品基质加标（2ppm） b. 果酱类食品空白基质

图8 果酱食品中对羟基苯甲酸酯类空白基质及基质加标（2ppm）

a. 果酱食品基质加标（2ppm） b. 果酱食品空白基质

图9 果酱食品中对羟基苯甲酸酯类空白基质及基质加标（2ppm）

按国标GB5009.31-2016检测方法线性范围和测定低限：

在1～500 μg/mL浓度范围内，以峰面积(y)与目标化合物浓度(x，μg/mL)绘制标准工作曲线。结果表明，在1.0～500 μg/mL质量浓度范围内，目标化合物良好线性关系，线性方程式、线性关系和测定低限(LOQ，S/N=10)见表2。

表2 线性方程式、线性相关系数和定量限

化合物	线性方程式	线性相关系数	定量限/(mg/kg)
对羟基苯甲酸甲酯	Y=0.532847x-1.26878	0.99915	2.0
对羟基苯甲酸乙酯	Y=0.563352x-1.13532	0.99972	2.0
对羟基苯甲酸丙酯	Y=0.554134x-2.50160	0.99915	2.0
对羟基苯甲酸丁酯	Y=0.530932x-4.29406	0.99971	2.0

回收率和精密度

分别向空白蚝油中添加目标物，做空白添加回收试验，添加水平为2.0、5.0、50.0 mg/kg，各添加水平分别做6次平行试验。加标回收率为88.7%～108%，相对标准偏差(RSD)为1.3～5.2%，方法的精密度及回收率均满足定量测定的要求，试验结果见表3。

总结：国标方法是用盐酸酸化样品，乙醚提取，浓缩后，用具有氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离检测，外标法定量；耗时长、成本高、消耗大、毒性强、工作效率低等弱点，极大的限制了在食品检测过程中的广泛运用，优点是谱图干净，几乎没有基质干扰的现象。针对食品检测工作中样品量大、基质干扰多、成分复杂且易变质腐败等特点，在检测过程中也需要建立一种准确高效的检测方法运用于实际工作；液相法是一种快捷、准确、适用范围广的方法，以满足检测工作的需要，达到提高工作效率的目的。遇到有基质干扰，不合格的样品时改用气相色谱法进行准确定量检测。