主题：【第十五届原创】克隆形成实验及划痕实验、流式细胞术操作步骤

克隆形成实验及划痕实验、流式细胞术操作步骤

软琼脂克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力

软琼脂克隆形成实验适用于悬浮生长的细胞。

1.    配胶液：用蒸馏水和琼脂糖粉配制浓度为 0.3% 的琼脂糖液，高压灭菌，置于42℃ 水浴锅中，目的是为了使其保持融化状态。
2.    配制含 20%    FBS 的 2×1640 培养基，用 0.22 ?m 的滤器过滤除菌。
3.    铺下层胶：将 0.6% 的琼脂糖胶液与 2×1640 培养基等体积混合，以每孔 1.5mL 加至 6 孔板中，室温等其凝固。
4.    细胞计数：将细胞用 PBS 洗一遍，离心，加入新的培养基混匀稀释，计数。H69-NC、H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-NC、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-NC、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2 均以 1×104/孔铺入 6 孔板。
5.    铺上层胶：将 0.3% 的琼脂糖胶液与 2× 培养基 1：1 混合，加入 100 μL 细胞悬液，混匀后，每孔加入 1.5 mL 混合液。
6.    放入 37℃，5%CO2 培养箱培养，约 2-3 周后终止培养。
7.    比较细胞克隆形成能力的差异，利用 Graphpad prism5 作图计算两种细胞克隆形成能力的差异。
平板克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力
平板克隆形成实验适用于贴壁生长的细胞。
1.    细胞处理：将 SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞，用 PBS洗一遍，用胰酶消化并计数。
2.    接种细胞： 将细胞接种于 6 孔板中， SW1271-NC 、SW1271-shMSI1-1 、SW1271-shMSI1-2 接种密度为 3×103/孔，注意一定让细胞均匀分布。于 37℃，隔离CO2 静置培养 2-3 周（终止培养时间以不小于 2 周且克隆之间不发生融合为标准）。
3.    出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去旧培养基， 用 PBS 清洗 2 次，用 4% 多聚甲醛固定液固定 20 min，吸除固定液，用蒸馏水清洗 2 次后加适量结晶紫染色15-20 min，用蒸馏水洗去结晶紫，自然风干，用扫描仪扫描成图片。
4.    在低倍镜下计数大于 50 个细胞的克隆数。
5.    计算克隆形成率。
细胞划痕实验
1.    用记号笔在 12 孔板底部划两条平行线做为标记。
2.    将 SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞接种至 6 孔板。
3.    待细胞汇合度为 90% 左右时，用 10μL 枪头垂直于两条平行标记线进行划痕。
4.    吸除培养基，1xPBS 漂洗 2 次，并换用无血清培养基培养。
5.    分别在划痕后培养 0h，12h，24h，48h，72h 观察细胞迁移情况并拍照。
流式细胞术
1.    收集 H69、H82、H526、SW1271 的对照组和实验组细胞(包括培养上清中的细胞)，收集 1 - 10 ×105 个细胞，用预冷 PBS 离心洗涤。用双蒸水稀释 5 ×Binding Buffer为 1 × 工作液，取 500 μl 1 × Binding Buffer 重悬细胞。
2.    每管加入 5 μl Annexin V-APC 和 10 μl 7-AAD。
3.    轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育 5 分钟。
4.    上机进行分析。