	药物/试剂	生产公司
西达本胺	深圳微芯科技公司
胎牛血清	Gibco
RPMI Medium 1640培养基	Gibco
Waymouth’s培养基	Gibco
PBS	Solarbio
HEPES	Solarbio
TRIzol	Ambion
氯仿	天津市北辰方正试剂厂
异丙醇	天津市北辰方正试剂厂
无水乙醇	天津市华东试剂厂
MonScriptTM RTLLL ALL-in-One Mix with dsDNase KitMonScriptTM ChemoHS qPCR MixKit	Monad

表2

药物/试剂	生产公司
DNase/RNase-Free Water	Solarbio
双抗	Solarbio
CCK-8	MedChemExpress
4%多聚甲醛	Solarbio
结晶紫	Solarbio
流式凋亡试剂盒	BD
DMSO	Solarbio
REGμLAR AGAROSE G-10	上海贝晶生物有限公司

（1）细胞处理：

H446、DMS114：吸弃培养基，PBS清洗2次，吸弃PBS，培养皿斜立于冰上，将剩余PBS吸干。培养皿中加入1 mL trizol，迅速吹打混匀，充分裂解细胞，移入1.5 mL无酶EP管中。

H69、H526：细胞悬液放入15mL离心管中，900 rpm 离心8 min，离心后弃上清，PBS清洗2次，弃掉PBS，加入1mL trizol，迅速吹打混匀，充分裂解细胞，移入1.5 mL无酶EP管中。

（2）加入200 μL氯仿（每1 mL trizol），剧烈震荡混匀30 s，室温静置10 min。

（3）离心，4℃，12000 g，15 min。将水相转移至新的1.5 mL无RNA酶EP管中。

（4）在水相转移液中加入异丙醇，异丙醇：转移液=1:1，上下颠倒混匀30 s（或用移液器上下抽吸混匀），室温静置10 min。

（5）4℃，12000 g，离心15 min，吸弃上清液。

（6）清洗RNA：在装有RNA沉淀块的EP管中加入1 mL预冷的75%乙醇（DEPC水：无水乙醇=1:3），轻微震荡，使沉淀漂浮起来，不要将RNA沉淀块弄碎。4℃ , 7500 rpm, 离心5 min，吸弃上清，再重复以上步骤2次。

（7）吸弃乙醇，将EP管再离心一次（4℃ , 7500 rpm, 离心2 min），用10 μL枪头尽量吸净剩余乙醇，将EP管水平静置于超净台内，干燥RNA至RNA团块变半透明状，吸取适量DEPC水溶解RNA沉淀，轻轻吹打，充分混匀，瞬时离心收集RNA于EP管底部（RNA溶解后立即置于冰上）。若不马上做逆转录，可将RNA保存于75%乙醇中。

（8）RNA浓度及纯度

用NanoDrop One检测RNA的浓度及纯度。具体操作如下：

a.清洗基座：开机后滴加1-2 μL去离子水于基座，浸泡10s，吸干水滴，重复三次。

b.空白校正：滴加1-2 μL DEPC水于基座上，放下检测臂，进行空白校正。

c.样本混匀：可用漩涡振荡器或手指轻弹方式混匀待检测的RNA样本（切记勿用枪头吹打或离心样品的方式混匀样本）。

d.检测样本：滴加1 μL混匀的RNA样本于基座，放下检测臂，检测样本。连续检测样本过程无需清洗基座，只需用无尘纸朝一个方向擦干基座即可。

e.清洗基座：RNA检测完成后清洗基座，步骤同第一步。

（9）反转录合成cDNA

具体合成步骤参照MonScriptTM RTLLL ALL-in-One Mix with dsDNase KitMonScriptTM ChemoHS qPCR MixKit试剂盒。

a.反转录试剂盒中各试剂解冻，并置于冰上。

b.轻弹各试剂并轻度离心。

c.按照下表于EP管中添加反转录试剂。

d.瞬时离心，上机温育，程序设定为37℃ ，2 min（去除基因组DNA污染）→ 55 ℃ ，15 min → 85℃ ，5 min（终止反应）→ 4℃，∞，得到cDNA。反转录生成的cDNA放入- 20℃冰箱保存，若想更长时间保存可放入- 80℃冰箱。

附件：

LN3.docx