主题：【第十六届原创】高灵敏度、高覆盖度的O-GlcNAc富集新技术研究

浏览0 回复0 电梯直达

石山

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

小时山检测发表于：2023/10/24 23:14:59 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

维权声明：本文为Ins_d822ac0b原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

高灵敏度、高覆盖度的O-GlcNAc富集新技术研究

针对O-GlcNAc修饰化学计量低、富集困难的问题，开发了两种高灵敏度、高覆盖度的富集方法。

第一种方法利用糖苷内切酶突变体 Endo-M N175Q 的转糖酶连接活性和野生型糖苷内切酶 Endo-M/S 的水解活性，提出并构建了 O-GlcNAc 修饰糖肽的可逆化学酶促标记策略，并与亲水作用色谱(HILIC)富集方法相结合，发展了一种基于可逆性化学酶促标记的 O-GlcNAc 糖肽无痕富集检测方法（如图a 所示）。该方法避免了标记糖链对鉴定效率的影响，实现了 O-GlcNAc 糖肽的高效富集与检测，从 1.1mg 细胞核蛋白样品中鉴定到超过 1400 个 O-GlcNAc 修饰位点，且其中很大一部分涉及转录调控和核转运等生物过程，具有结合蛋白质、 DNA 和 RNA 的分子功能，提示O-GlcNAc 修饰与蛋白质结合 DNA/RNA 存在紧密联系，为后续的 O-GlcNAc 功能调控研究提供数据支持。

第二种方法基于化学酶促标记可逆羟胺富集，利用 Gal-T1 Y289L 突变酶宽松的供体底物特异性和严格的受体底物特异性，向 O-GlcNAc 糖肽上引入含有酮基的N-乙酰化半乳糖胺(GalNAc)进行标记，通过酮基与羟胺之间的可逆肟建形成的化学方法，利用带有羟胺基团的硅球对标记的糖肽进行捕获，使用甲氧胺小分子释放肽段（如图b 所示），实现了O-GlcNAc 糖肽的一步标记与一步富集。在 3mg HeLa 细胞全蛋白样品中共鉴定到 586 种O-GlcNAc蛋白上的 2424 处潜在 O-GlcNAc 修饰位点，其中有38.7% 的蛋白有超过5个糖基化位点，取得了目前 O-GlcNAc 修饰鉴定的最高灵敏度（常规点击化学法使用 3–8 mg 蛋白质可检测到400–600 处 O-GlcNAc 修饰）。该方法具有操作简便、富集特异性强、鉴定效率高的优势，适用于存在大量高丰度非糖肽的复杂生物样品，为 O-GlcNAc 蛋白质组分析提供了实用的工具。

在两种富集策略的数据中，YTHDF1 和 YTHDF3均被鉴定为O-GlcNAc 修饰蛋白，使用 Metascape 软件对鉴定到的 O-GlcNAc 修饰蛋白进行相互作用分析，发现结果中包括 Notch-HLH 转录通路和脂肪生成在内的多种功能（如图c所示），其中一个尤为值得关注的相互作用网络是被报道对受热、氧化应激、渗透压等条件刺激作出响应的应激颗粒(stress granule, SG)组装过程。 m6A（一种 RNA 修饰）与 SG 的形成密切相关，且 m6A 读取蛋白 YTHDF1 和YTHDF3 也被报道可在胞浆中充当组装 SG 的种子，已有研究报道YTHDF1的O-GlcNAc 修饰通过与CRM1相互作用介导其出核，所以我们猜测O-GlcNAc 修饰可能改变 m6A 读取蛋白在细胞中的定位，进而参与 SG的形成和复原过程，其具体机制仍有待未来研究的评估。