主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之十二）

蜂蜜中链霉素残留物的Charm II测定和液相色谱柱后衍生化-荧光检测验证
Detection of Streptomycin Residues in Honey Using the Charm II-test and Confirmation of Results through HPLC with Post-column Derivatisation and Fluorescence Detection

引言

自1994年植物保护剂植物抗生素在德国被有严格条件的、暂时的和极为有限的允许用于控制水果的Feurbrand，它已被欧洲的其他一些国家和美国使用了好几年。含有有效成分链霉素的植物抗生素部分用于花期，这导致了蜂蜜中氨基糖苷抗生素的残留。由Usleber等[1]介绍的用于测定蜂蜜中残留的酶化学免疫法测定结果在10~100μg/㎏。但是由于链霉素和双氢链霉素之间高度交叉反应，因此用ELISA法不能说明这两种抗生素的差别。所以需要研究一种有足够灵敏度的方法验证。
HPLC法是在Gerhardt等[2]提出在线富集HPLC测定纤维中链霉素的方法和Usleber等[1]提出的方法基础上提出的。因为当时市售ELISA试剂盒灵敏度不够，基于测定美国Charm Science公司放射受体试验（Charm II 试验）的方法较适合于链霉素检测的筛选。

Charm II-实验
试剂
-CharmII链霉素试剂盒（LD Labor Diagnostika，Heiden）
-MSU 和 M2缓冲液（试剂盒附带）
-玻璃棉，以磷酸处理

样品条件
厂方并未提供蜂蜜样品的处理方法，按材料[3]样品处理方法进行如下处理：
取10g蜂蜜于聚四氟乙烯离心管内，加10mL MSU 缓冲液，在震荡机上震荡10分钟，直至蜂蜜完全溶解。经玻璃棉过滤，以M2缓冲液调滤液pH至7.5。按厂方说明进行测试，不过测试前必须静置1小时以上，以获得恒定的测定值。

分析和讨论
此实验分析是半定量的。每组实验至少有两个浓度在10到30μɡ∕㎏之间的加标样品。通过对于这些阳性控制样品测定值的比较，高于20μɡ∕㎏链霉素的样品就可以得到确认。10到20μɡ∕㎏的测定值也可以清楚地与空白样区分，用这个方法不能确切的测定小于10μɡ∕㎏的链霉素，因为控制样（标样）也会在一定范围内波动。
可以确定，用这种方法测定双氢链霉素也有大致相同的灵敏度。正如ELISA法一样由于双氢链霉素的交叉反应有时结果会大于100%[4，5]。CHARM II法的优点在于样品的制备和实验过程十分简便和快速。只要有所需的仪器设备，与ELISA法相比这种方法更为有效，即使是少量的样品。

HPLC方法
* 译自Lebensmittelchemie 50, 115-117, (1996).
化学试剂和溶液
-用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配制磷酸盐缓冲液（0.2mol/L,pH 8）；
-0.2mol/L氢氧化钠 (称8g氢氧化钠溶于1L水)，按使用要求过滤和脱气。
-pH 2的高氯酸溶液（用水稀释高氯酸）
-醋酸 99.7%
-玻璃棉,以磷酸处理
-阳离子交换柱:苯磺酸-固相柱（SO3H）（Baker３ｍL，Order No。7090-03）。采用其他牌号时需要在使用前检查回收率。
-C18-固相柱：将500mg C18担体（Flash）（Baker， Order No.7025-00，Batch F 01081）在3mL玻璃柱中用10mL甲醇浸湿然后装填在聚四氟乙烯小管中。采用其他牌号时需要在使用前检查回收率。
-甲醇,正己烷,叔丁基甲基醚(TBME)
-硫酸链霉素（）
-庚基苯磺酸水溶液：0.5 mol/L（用Serva 公司 1-庚基苯磺酸钠盐制备）
-HPLC溶液（B）：10 mmol/L，pH 3.3（2.02g 1-庚基苯磺酸钠盐溶于水，用乙酸调pH至3.3）
-溶剂系统A：1-庚基苯磺酸（10mmol/L）和1.2-萘醌-4-苯磺酸（0.4mmol/L）的水溶液+乙腈（80+20）；用乙酸调pH至3.3；当天新配置（否则会降低灵敏度并升高背景信号）。
-溶剂系统B：乙腈

参比溶液及其配制
母液：100mg链霉素溶于100mL水中（1000μɡ∕mL）
工作液（A）：1mL母液溶于100mL水中（10μɡ∕mL）
使用液：2mL工作液溶于10mL水中（2μɡ∕mL）：使用前新配制。
外标液：
mL A + mL H2O加10 mL B =μɡ∕mL
0.1 0.9 0.1
0.2 0.8 0.2
0.3 0.7 0.3
0.5 0.5 0.5
配置: 将100μL (150μL, 250μL)使用液加入10ɡ 蜂蜜中，静置5分钟(20,30,50μɡ∕㎏)

样品处理
称取10g蜂蜜于可密封聚四氟乙烯离心管中, 加25mL高氯酸溶液,在震荡器(250/min)上震荡10分钟直至蜂蜜完全溶解。
用阳离子交换柱进行首次净化，用5mL水和2mL高氯酸浸泡。将蜂蜜溶液离心（10分钟，4500 G/min）上清液通过填有玻璃棉的漏斗过滤至备用容器中用于固相萃取，在抽真空条件下通过固相柱。然后用5mL高氯酸溶液清洗漏斗。阳离子交换柱用10mL水清洗，洗脱液和20mL磷酸缓冲液一起放到离心管里。加入2mL 庚基苯磺酸溶液, 滴加磷酸调整pH至2。
为了进一步的净化和浓缩，需用5mL水浸湿已准备好的C18固相柱。为避免堵塞，这根柱子要再离心10分钟（4500 G/min）。再把上清液倒入容器中再慢慢让其流过固定柱。在用10mL水清洗（吸干5分钟）和4mL TBME/己烷（80/20）清洗（吸干5分钟）后为去除残余水分在低真空条件下用6 mL甲醇再洗涤至沉渣瓶。用旋转蒸发器将洗脱液浓缩至很小体积，残余液体用氮气吹干。只要还有残余的水分就要用乙醇在旋转蒸发器上去除。借助于玻璃搅拌器把残渣溶于1mL HPLC溶液中，玻璃部分要以溶剂湿润，把溶液转移到微型样品瓶中。如果不是当天测定样品瓶要冷冻保存。在室温下解冻20-30分钟后按要求离心（4000G/min）
样品制备要点
对于大多数蜂蜜样品可以采用不用阳离子交换柱的简单办法制备。把样品蜂蜜溶于25mL缓冲液（1-庚基苯磺酸 50mmol/L，磷酸钠，25mmol/L，用磷酸调pH至2），按上述步骤离心，过滤，再通过玻璃棉漏斗过C18柱，后续操作同上。
要确证阳性结果，无论如何要增加阳离子交换净化步骤，以便得到干净的基线。特别是色泽很深的蜂蜜，尽管离心和过滤，在2-3小时里还是不能顺利通过离子交换柱。在这种情况下我们建议采取反复处理少量蜂蜜再添加到一起的办法。

液相色谱条件
液相色谱仪 惠普1090 II型
色谱柱： Hypersil BDS C-18
100×4 mm； 3μm（HP）
预柱： ODS 20×2.1mm；
10μm（自填充）
柱温： 40 ℃
进样体积： 100μL
流速： 0.8mL/min
溶剂系统：等梯度操作(98% 溶剂 A+2%溶剂 B)
柱后衍生化
柱后衍生化系统 655A-13型(Merck Hitachi)
试剂: NaOH 0.2 mol/L
流速: 0.4mL/min
温度: 50℃
反应盘管: 长10m, 内径0.33mm(Merck)
荧光测定
荧光检测器HP 1046A
激发波长λex=263nm,发射波长λem=435nm
增益:11