主题：【原创】一个液相色谱操作者的成长日记（更新至145楼）

原文由 wonboy(wonboy) 发表:
老多楼主好像不怎么光顾了啊，有问题急需指点，请看到后回复，非常感谢。之前在LC板块发过一个求助帖，不过问题没有提得很详细，看到楼主的帖子后深受启发，把实验的具体操作详细的列出来，望专家指点。

    我最近在做HPLC检测鱼体中的辛硫磷-一种有机磷农药，其实我建立检测方法的目的是为后面做辛硫磷在鱼体中的动态残留打基础的。我用的机子是Waters的（具体型号没注意），自动进样，检测器是2996PDA的，可全波段扫描。标品购自国家标准开发中心，含量100ug/ml，溶解介质是石油醚。刚开始我是想用40%辛硫磷乳油来做的，结果做了很多次都不出峰。刚开始直接用纯甲醇溶解乳油，配置成各浓度的溶液，进样后出的峰很怪异，即使浓度很大检测器的响应值也很小，而且跟标品对比保留时间相差太远。后面用流动相稀释乳油，还是跟标品保留时间不一致。一直做了一两个星期问题依旧无法解决。后来查阅文献，发现做这种农药残留的大都用农药原药来做，原药的话一般纯度能达到90%以上，杂质的影响较小。没的说，买原药吧。还好比较顺利，三四天后原药就搞到手了，纯度为92%，液体。原药是中午拿到手的，下午立刻就去扫了紫外，扫出来的图跟标品几乎完全相同，当时那叫一个兴奋啊，恨不得立刻上Warters试试看。但是我没有这条件，液相是整个学院公用的，一两个星期才能排到一次，一次也就10小时，没办法，等呗。好容易等到上机的那天，极度兴奋。因为还在摸条件，流动相是80%的甲醇，流速1，柱温当时也没设置，进样量20，柱子是国产的比较垃圾，凑合着还能使吧。先跑平基线，进标品，再进原药（原药是直接用甲醇溶解的），结果大失所望，标品5min出峰，原药8min出峰（最大峰），这这完全无法解释啊，本来是一种物质的差距怎么就这么大呢？再进标品，再进原药，色谱峰还是那样，真叫一郁闷啊。希望破灭，美梦落空。后来考虑到溶剂效应，直接用流动相稀释配置原药溶液，峰依旧没有改观。后面也试了其他配比的流动相，60%，50%都试过，柱温后来也设置为恒定的35°了，但是问题依旧存在，实在是束手无策了。
个人觉得可能的原因是：
1 标品或者原药有问题
2试验操作有问题。因为我接触液相也就几个月时间，连基本的理论、操作什么的都是一知半解，哪个小环节出了问题自己也不太清楚。
3仪器或者色谱条件的问题基本可以排除。文献上检测辛硫磷也是用的甲醇-水流动相，貌似效果都不错。
方法建立不了，后面的试验也就无从入手了，我进试验室都半年了，研二上学期转眼就过去了，还是毫无成就，没有拿得出手的数据，心里很着急，老板看我半年没东西肯定也看我不爽。各位大侠给小弟把把脉，诊断一下，看到底是哪里出了问题。

原文由 wonboy(wonboy) 发表:
老多楼主好像不怎么光顾了啊，有问题急需指点，请看到后回复，非常感谢。之前在LC板块发过一个求助帖，不过问题没有提得很详细，看到楼主的帖子后深受启发，把实验的具体操作详细的列出来，望专家指点。

    我最近在做HPLC检测鱼体中的辛硫磷-一种有机磷农药，其实我建立检测方法的目的是为后面做辛硫磷在鱼体中的动态残留打基础的。我用的机子是Waters的（具体型号没注意），自动进样，检测器是2996PDA的，可全波段扫描。标品购自国家标准开发中心，含量100ug/ml，溶解介质是石油醚。刚开始我是想用40%辛硫磷乳油来做的，结果做了很多次都不出峰。刚开始直接用纯甲醇溶解乳油，配置成各浓度的溶液，进样后出的峰很怪异，即使浓度很大检测器的响应值也很小，而且跟标品对比保留时间相差太远。后面用流动相稀释乳油，还是跟标品保留时间不一致。一直做了一两个星期问题依旧无法解决。后来查阅文献，发现做这种农药残留的大都用农药原药来做，原药的话一般纯度能达到90%以上，杂质的影响较小。没的说，买原药吧。还好比较顺利，三四天后原药就搞到手了，纯度为92%，液体。原药是中午拿到手的，下午立刻就去扫了紫外，扫出来的图跟标品几乎完全相同，当时那叫一个兴奋啊，恨不得立刻上Warters试试看。但是我没有这条件，液相是整个学院公用的，一两个星期才能排到一次，一次也就10小时，没办法，等呗。好容易等到上机的那天，极度兴奋。因为还在摸条件，流动相是80%的甲醇，流速1，柱温当时也没设置，进样量20，柱子是国产的比较垃圾，凑合着还能使吧。先跑平基线，进标品，再进原药（原药是直接用甲醇溶解的），结果大失所望，标品5min出峰，原药8min出峰（最大峰），这这完全无法解释啊，本来是一种物质的差距怎么就这么大呢？再进标品，再进原药，色谱峰还是那样，真叫一郁闷啊。希望破灭，美梦落空。后来考虑到溶剂效应，直接用流动相稀释配置原药溶液，峰依旧没有改观。后面也试了其他配比的流动相，60%，50%都试过，柱温后来也设置为恒定的35°了，但是问题依旧存在，实在是束手无策了。
个人觉得可能的原因是：
1 标品或者原药有问题
2试验操作有问题。因为我接触液相也就几个月时间，连基本的理论、操作什么的都是一知半解，哪个小环节出了问题自己也不太清楚。
3仪器或者色谱条件的问题基本可以排除。文献上检测辛硫磷也是用的甲醇-水流动相，貌似效果都不错。
方法建立不了，后面的试验也就无从入手了，我进试验室都半年了，研二上学期转眼就过去了，还是毫无成就，没有拿得出手的数据，心里很着急，老板看我半年没东西肯定也看我不爽。各位大侠给小弟把把脉，诊断一下，看到底是哪里出了问题。

原文由 老多_小多(emoc98311) 发表:
拆单向阀：

由于样品量大，晚上仪器也在工作，下班之前就设置好了进样的序列且设置了自动停泵。第二天早上来，听到仪器一直在鸣笛报警，过去一看，原来是没压力了，流速也停了。我在仪器上检查了一下，原来是流动相走空了。明明设置了程序停泵，怎么没停呢？检查了下程序，发现是程序设置错误。我想流动相走空了，也没什么大不了，换上水，用仪器的程序灌泵吧。我换上水灌泵后，结果问题来了：发现没有废液排出来，压力也显示没压力。
因为仪器急着用，只好打电话问工程师了，得到了答案：这个现象通常都是因为气泡或是杂质进入了单向阀造成，这样我们就要拆开泵单向阀，把单向阀取出来,拆出来后把单向阀摇晃几下（能听见宝石的声音）或是超声再安装上去即可（注意方向）。照着工程师的方法，仪器问题很快就解决了。