主题：【分享】智能型色谱整体固定相的研究进展

随着生命科学环境科学食品科学和医药科学等研究新领域的不断涌现和发展，对实现复杂体系的高分辨高选择性高精确度高灵敏度和高通量的分离分析提出了更高的要求，色谱技术作为一种强大的分离分析手段，始终推动着自然科学和国民经济的发展
色谱固定相作为色谱技术的核心，不仅是色谱方法建立的基础，也是一种重要的消耗品，因此，发展新型的色谱固定相一直是人们研究的目标 整体
柱最早出现于20世纪60年代［1］，是一类由单体引发剂致孔剂等混合物通过原位制备而成的棒状整体，相较于传统颗粒堆积柱，其具有高渗透性快速
传质和易于化学修饰等优点［2］而被广泛应用于生物分离分析［3，4］催化［5，6］和吸附［7，8］等领域，被誉为第四代色谱固定相 目前，根据材料的性质，整体柱
可分为有机聚合物整体柱无机介质整体柱和杂化材料整体柱 尽管柱体种类较多，但整体柱应用范围的拓展更多地取决于其表面化学，因此，采取不同的方法和引入不同的材料来控制整体柱表面的化学性质已成为当前研究的热点
智能型聚合物( 即环境敏感性聚合物) 作为一类新型功能性材料，因能够对外界或内部环境变化( 如温度pH盐光等) 做出快速响应而被广泛应用于药物控释生物抗污和组织工程等领域［9－11］将智能型聚合物引入到色谱固定相中能赋予其新特性和新功能，不仅使分离过程调控简单，而且能避免有机溶剂的使用，使整个分离过程绿色环保，为色谱固定相的应用提供了新的思路 目前已有较多将智能型聚合物修饰的微球作为色谱固定相的报道［12－22］，如首先合成温敏性的聚合物，然后再修饰到氨丙基功能化的硅球表面作为色谱固定相［12－15］; 或在有引发基团的硅球或聚苯乙烯球表面采用活性自由基聚合( 原子转移自由基聚合可逆加成-断裂链转移聚合等) 原位引发接枝温敏性聚合物链作为色谱固定相［16－19，21］整体柱作为新一代色谱固定相，有着广泛的应用前景，本文主要综述了近年来智能型整体柱的制备和应用研究进展
1： 智能型整体柱的制备方法整体柱材料可以通过其表面化学修饰来实现其在不同应用中的需求，如整体柱表面修饰疏水基团后能用作反相色谱固定相，修饰离子化基团后可用作离子交换色谱固定相，修饰手性基团后可用于对映异构体的分离［23］目前，实现整体柱表面功能化的方法主要有化学键合法直接共聚法和表面接枝法，但用于智能型整体柱的表面修饰方法主要集中在直接共聚法和表面接枝法，这是因为化学键合法是将所需官能团直接与柱体表面反应，主要针对的是小分子的修饰，而不是聚合物

1．1 直接共聚法
直接共聚法是在整体柱的制备过程中引入功能单体来制备得到功能性整体柱，该方法在有机聚合物整体柱的制备中应用较多 除了常用的水溶性单体( 如丙烯酰胺甲基丙烯酸羟乙酯) 疏水性单体( 如苯乙烯甲基丙烯酸叔丁酯) 和手性单体( 如2-乙烯基-4，4-二甲基二氢吖内酯) 外，用于制备智能型材料的单体( 如N-异丙基丙烯酰胺丙烯酸二甲基氨基甲基丙烯酸酯) 也被直接用来共聚以功能化整体柱 Krajnc等
［24］以甲叉双丙烯酰胺( BIS) 为交联剂，采用高内相比乳液模板法制备得到聚苯乙烯/聚丙烯酸( PS/PAA) 和聚苯乙烯/聚( N-异丙基丙烯酰胺) ( PS/PNIPAAm) 共聚的整体柱，使整体柱分别具有pH敏和温敏特性 直接共聚法虽然只需一步即可完成，过程简单，但是使用新功能单体时往往需要重新优化反应体系，且功能单体的直接共聚易使其包埋在柱体空隙中而使柱体表面的功能团减少，不利于整体柱色谱性能的体现
1．2 表面接枝法
表面接枝法不仅能克服上述直接共聚法的缺点，而且相较于直接共聚法修饰的单层功能团来说，表面接枝法可以在柱体表面修饰聚合物长链以有效地提供多位点功能团，从而增加表面功能团的密度，提高柱体的吸附容量［23］
目前，表面接枝法通常可以分为两种，即grafting-to 和grafting-fromgrafting-to 是指先制备得到在链末端或侧链存在活性官能团的聚合物，然后通过活性官能团将聚合物共价修饰到固相载体表面［25］Titirici 研究小组［26］采用可逆加成-断裂链转移( RAFT) 聚合方法在溶液中可控聚合制备得到带有羧基的PNIPAAm，然后原位偶联到修饰有氨基的硅胶整体柱表面 但是，grafting-to 方法存在其本身的不足: 聚合物需要扩散到固相载体表面以实现其固定，但随着聚合物固定量的增加，其本身存在的空间位阻会限制溶液中聚合物向固相载体表面的进一步扩散，从而不利于其接枝密度和固定量的进一步增加［27，28］; 此外，该方法操作步骤较繁琐，需前期聚合物的制备纯化和官能团修饰
grafting-from 是指先在固相载体表面修饰上引发基团，然后采用原位接枝的方法在其表面生长出聚合物链［29］Peters等［30］制备聚( 甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯) ( poly( GMAco-EDMA) ) 整体柱后，利用柱体表面存在的环氧基团与烯丙胺反应产生双键，然后原位引发接枝PNIPAAm聚合物链，制备得到温敏聚合物整体柱Mittal 研究小组［31］采用无皂乳液聚合制备得到聚苯乙烯微球，并在其表面修饰原子转移自由基聚合引发剂，然后利用高剪切技术使该功能化微球聚集为交联网络结构而形成整体柱，再在其表面原位引发接枝PNIPAAm，最终制备得到微球堆积结构的温敏性整体柱 由于在grafting-from 方法中聚合物链是从固相载体表面原位生长出来的，因此，扩散到固载表面实现固定的是单体而不是聚合物，这样空间位阻大大减小，有利于聚合物接枝密度和固定量的增加［27，32］，而且制备过程简单grafting-to 和grafting-from方法的示意图见图1

2 智能型整体柱的种类
2．1 温敏整体柱
温敏整体柱是研究最多的一类环境敏感性整体柱，能通过温度的变化来调节其表面的亲疏水性质，从而实现不同物质的分离 目前，普遍接受的响应机理是整体柱中感温高分子部分同时存在亲水基团和疏水基团，在水相中能与水分子发生相互作用，当温度低于临界溶解温度( LCST，即最低浊点温度)时，亲水基团和水分子间的氢键作用占主导地位而在聚合物周围形成溶剂化壳层，使聚合物链伸展，呈现亲水特性; 随着温度的上升直至其高于LCST时，聚合物和水分子间的氢键断裂，溶剂化层被破坏，疏水基团间相互缔结的作用力占主导地位，使聚合物链聚集和卷曲，呈现疏水特性 因为温敏整体柱能在纯水条件下，仅通过温度的改变来实现物质的分离分析，所以可避免有机溶剂的使用，整个过程环境友好而无污染 这一特点正好弥补了传统反相液相色谱中分析生物大分子的不足 众所周知，生物大分子的传统色谱分析方法是采用反相C18柱，利用其疏水性质在乙腈或其他有机溶剂存在的酸性条件下进行的，有机溶剂的使用不仅易使生物分子失活，而且限制了被分离物质的进一步应用［33］尽管后来出现了疏水作用色谱( HIC) 以实现基于其疏水性质的蛋白质和多肽的分离，避免了有机溶剂的使用，但整个分离过程是通过流动相中的高盐来促进生物大分子的盐析作用而使其疏水保留在柱体上，这样的操作过程仍然易诱使生物大分子发生结构的改变，进而破坏其生物活性［33］正因为传统色谱分析方法的种种限制，使得发展一种以纯水为流动相，价格低廉且不会破坏生物大分子活性的新型分析系统成为迫切的需要，而温敏整体柱的出现正好填补了这一空白，为生物大分子的分离分析提供了新思路和新启示，同时也使该类整体柱成为最受欢迎的新型色谱整体固定相之一
目前，常见的温敏高分子聚合物有PNIPAAm聚乙烯吡咯烷酮( PVP)［34］聚( 2-恶唑啉)［35，36］和寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯［37，38］等 其中，PNIPAAm是最具代表性和被研究最多的聚合物，其LCST在32℃附近，这一温度非常接近人体的生理温度( 37℃) ， 且其相变行为不易受其他环境因素如pH或盐浓度的影响，因此，十分有利于拓展其在生物领域的应用 Toomey等［39］采用软刻蚀法在硅基质表面制备得到交联的PNIPAAm水凝胶图案，依据温度的变化，水凝胶会发生横向的溶胀和接触，使得整体柱间空隙形成的通道能用来捕获和释放不同尺寸的目标物 杨更亮研究小组以NIPAAm为单体，以BIS为交联剂，采用传统自由基聚合直接共聚得到温敏poly( NIPAAm-co-BIS) 整体柱，并考察了单体和交联剂浓度对柱体形貌的影响以及温度对柱体结构和分离分析的影响; 结果表明: 随着交联剂浓度的增加，整体柱会由凝胶状转变为具有较好机械强度的柱体，且柱体的渗透压也会随着温度的升高而减小，所制备得到的柱体能在55℃时实现3种芳香酮和6种激素类物质的分离［40，41］除了采用直接共聚法制备得到温敏整体柱外，Titirici 研究小组［26］采用grafting-to 策略，将用RAFT方法制备得到的带有羧基的PNIPAAm修饰到含有氨基的硅胶整体柱表面，然后以纯水为流动相，在等度条件下实现了5种激素类药物的分离分析，并和商品化RP18硅胶整体柱进行对比，结果表明: 在55℃时，PNIPAAm修饰的硅胶整体柱能实现5种激素的基线分离; 而在RP18柱上( 40℃，甲醇/水为50∶ 50) ， 油水分配系数logP接近的两种激素氢化可的松( logP=1.47)和氢化泼尼松( logP=1.62) 却无法分离开来，这可能是由于C18柱疏性太强而使其无法分辨出这两种激素的细小差异; 相反，硅胶整体柱表面处于聚集状态的PNIPAAm链含有可产生氢键作用的极性基团( NH，C=O) ， 因此，能与氢化可的松和氢化泼尼松的功能基团发生某些极性作用，从而有利于其分离［26］在grafting-to 方法的基础上，Okano研究小组［42］在连续棒状硅胶整体柱表面修饰上含有氯原子的ATRP引发剂，采用接枝可控的graftingfrom方法原位引发修饰PNIPAAm聚合物链，并对温敏聚合物链的接枝量和接枝密度进行了考察，发现: 该PNIPAAm修饰的棒状硅胶整体柱与PNIPAAm修饰的硅球填充柱相比，不仅分离时间短，而且分离效率高，当温敏硅胶整体柱在接枝密度较稀时能在5min内实现5种激素类物质的较好分离，而接枝密度较浓时能在10min内实现它们的完全分离 我们研究小组也开展了相应的研究，我们首先制备得到了聚( 二乙烯基苯-共-苯乙烯基苄氯)( poly( CMS-co-DVB) ) 整体柱，再利用其表面存在的氯原子，采用电子转移活化原子转移自由基聚合( ARGETATRP) 在其表面原位引发接枝( graftingfrom方法) PNIPAAm聚合物链，并在55℃纯水条件下实现3种激素类物质的基线分离，同时还考察了甲醇相中温度变化对分离效果的影响，结果表明:流动相中甲醇的引入并不利于分离的进行［43］此外，为了拓展聚合物整体柱的单体范围，我们研究小组还利用缩聚反应制备得到了基于E51环氧树脂的聚合物整体柱，然后利用溴异丁酰溴产生卤原子，同样采用ARGETATRP方法原位接枝温敏聚合链PNIPAAm，并以激素类物质为模板分析物，发现其保留能力会随着温度的升高而增强［44]
聚( 2-恶唑啉) 类物质作为另一类温敏聚合物，为PNIPAAm的同分异构体，其氮原子部分位于主链中，且其不同共聚物的LCST可以通过共聚物的组成来进行调控 因其具有好的生物相容性而被广泛用于药物运输系统或温敏材料［45］Titirici 研究小组［33］将两种2-恶唑啉类单体( 即2-N-丙基-2-恶唑啉( NPOX，LCST=23.8℃) 和2-异丙基-2-恶唑啉( IPOX，LCST=23.8℃) ) 共聚，得到组成为［IPOX］∶［NPOX］=32∶ 15的P( IPOX-co-NPOX) 共聚物，其LCST为42℃，然后通过grafting-to 方法将聚合物的氨基链末端连接到预先修饰有腈基的硅胶整体柱表面，通过元素分析计算得到整体柱表面的腈基数目为504 g/m2，聚合物的接枝密度为0.029chains/nm2并将此柱体与之前制备的具有相同接枝密度和聚合物相对分子质量的SiPNIPAAm整体柱进行比较，发现: 在Si-PNIPAAm整体柱上能实现5种激素类物质的基线分离，但在SiP( IPOX-co-NPOX) 柱体上地塞米松( log P=1.83)和醋酸氢化可的松( logP=2.45) 无法分离，而疏水性更接近的氢化可的松( logP=1.47) 和氢化泼尼松( log P=1.62) 却可以分开，该结果表明: Si-P( IPOX-co-NPOX) 的疏水性更强 产生这种现象的可能原因是PNIPAAm的含N部分位于侧链，而2-恶唑啉类聚合物的含N部分位于主链，当温度高于LCST，聚合物链发生聚集时，分析物和聚合物链除了疏水-疏水相互作用外，分析物还会扩散到聚集的聚合物链内部，此时地塞米松和醋酸氢化可的松与PNIPAAm链上氨基的作用对其分离起到至关重要的作用，而2-恶唑啉类聚合物的含N基团不易接近，因此对其达不到分离的效果［33］
尽管如此，因为PNIPAAm和聚( 2-恶唑啉) 具有不完全生物惰性，其含有的多个次级氨为氢键的良好供体和受体，易和天然聚酰胺类物质如蛋白质
发生相互作用，所以仍然会限制它们在生物分离方面的应用，特别是蛋白质和酶的分离 然而，人们研究发现: 基于低聚乙二醇的温敏聚合物不仅在水溶液中有可逆的相转变行为，而且其由生物惰性的环氧乙烷单元组成，有利于其在生物领域的进一步应用 此外，基于低聚乙二醇温敏聚合物的LCST还可以通过共聚单体组成进行调控 Titirici 研究小组以N-琥珀酰亚胺基-2-溴异丁酸酯为引发剂，采用ATRP方法随机共聚单体2-甲基-2-丙烯酸-2-( 2-甲氧基乙氧基) 乙酯( MEO2MA) 和聚( 寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯) ( OEGMA，Mn ～475g/mol) 制备得到不同链长和组成的P( MEO2MA-co-OEGMA) ， 然后，利用所得聚合物链末端的N-琥珀酰亚胺酯基，再采用grafting-to 方法原位连接到预先修饰有氨基的硅胶整体柱表面，通过元素分析计算得到硅胶整体柱表面氨基的量为453 g/m2，聚合物链的接枝密度为233～402 g/m2当温度高于LCST时，在一定的聚合物组成和纯水条件下，该温敏整体柱能实现5种激素类物质的基线分离，同时分析物的保留时间延长，表明分析物和柱体间以疏水作用为主，和PNIPAAm修饰的整体柱具有类似的结果［26］; 然而，当温度低于LCST时，P( MEO2MA-co-OEGMA) 修饰柱体却更有利于log P接近的亲水性分析物的分离 此外，柱体表面聚合物的组成对LCST影响较大，同时对激素的分离效果影响明显 和PNIPAAm相比，P( MEO2MA-co-OEGMA) 因具有一定的化学惰性，使得该聚合物P( MEO2MA-co-OEGMA) 修饰的柱体能在45℃下实现对溶菌酶和肌球蛋白的快速分离; 但是，蛋白质峰的拖尾现象表明: 除了疏水作用力外，还存在蛋白间的其他多种作用力［46］
2．2 pH敏整体柱
除温敏聚合物外，pH敏聚合物是另一类广受关注的环境刺激响应性材料，其一般含有大量的易水解或质子化的酸碱性基团，如羧基氨基等 这些基团在外界pH环境发生变化时，会吸收或者释放质子而引起离子作用氢键作用及疏水作用的变化，进而使聚合物发生自身构象的变化［11，47］生物科学等领域［47，48］目前，常见的pH敏聚合物有聚丙烯酸( PAA) 聚甲基丙烯酸( PMAA) 等含酸性基团的聚合物及聚( 二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯) ( PDMAEMA) 聚( 二乙基氨基甲基丙烯酸酯)( PDEAEMA) 聚2-乙烯吡啶( P2VP) 和聚4-乙烯吡啶( P4VP) 等含碱性基团的聚合物 冯钰锜研究小组［20］近年来已成功采用原位接枝的方法在修饰有偶氮基团的硅球表面共聚丙烯酸( AAc) 和丙烯酸丁酯( BA) 得到具有pH敏的色谱固定相，通过pH改变带来固定相表面疏水性质的变化而实现反相色谱模式和亲水色谱模式间的转换，并成功用于异黄酮类物质和核苷酸的分离
目前，国内外对于pH敏整体柱的制备研究仍然较少 我们研究小组成功制备得到poly( GMAco-EDMA) 整体柱，再通过酸解开环得到活性羟基，然后以过硫酸钾为引发剂利用氧化还原引发原位接枝( grafting-from 方法) 修饰PMAA得到pH敏的色谱整体固定相 根据不同pH条件下柱压降及柱体形貌的变化可知该柱体具有pH响应特征; 此外，与未修饰的整体柱相比，苯系物在PMAA修饰柱体表面保留行为的变化( 即保留能力随着pH的升高而降低) ， 表明如下响应机理: 当流动相的pH
为4.5时，PMAA聚合物链呈电中性，和小分子分析物间表现出较强的疏水作用; 当pH值为7.5时，聚合物的羧酸基团发生解离，聚合物链在离子排斥作用下会发生伸展，表现出一定的亲水性质，和疏水性分析物间作用较小而使其保留减弱 同时，我们还发现: 此色谱固定相不仅具有pH敏的特征，还能实现蛋白质的分离分析［49］我们研究小组还进一步采用ATRP方法制备得到聚二甲基丙烯酸乙二醇酯( poly( EDMA) ) 整体柱，然后利用柱体上残留的Br原子进行二次ATRP反应，通过grafting-from方法在柱体表面原位引发接枝PDMAEMA聚合物链，发现: 此聚合物链在pH5.0时，其叔氨基团发生质子化而带正电荷，为了最大程度地减小电荷间的排斥作用，聚合物链伸展而表现出较强的亲水作用，体现为激素类药物保留能力的减弱; 而随着pH的升高，当大于其pKa =7.6时，叔氨基团会逐渐去质子化而表现出较强的疏水作用，并发生聚合物链的卷曲，体现为激素类药物保留能力的增强 值得一提的是此聚合物链还表现出一定的盐敏特征［50］
2．3 盐敏整体柱
聚电解质的盐敏特性和其pH敏特性往往是息息相关的，因为pH敏的聚合物在特定pH条件下会发生解离，此时无机盐的加入会破坏聚合物周围的水化层而使其发生收缩，表现为聚合物链疏水性质的变化，这也是聚电解质的特征之一［51，52］如上所述，我们研究小组采用两步ATRP方法制备得到具有pH敏的PDMAEMA修饰的poly( EDMA) 整体柱，该柱体还具有盐敏特性，随着NaCl 盐浓度的增大，聚合物链表面的水化层逐渐被破坏，聚合物链的疏水性增强，从而使激素类药物的保留能力也随之增强［50］
此外，除了聚电解质，非电解质聚合物也会表现出一定的盐敏特征 据文献［53］报道，PNIPAAm除了温敏特征外，其侧链的极性基团( -CONH-) 还会和无机盐( 如氯化钠硫酸钠和氯化钙) 发生相互作用，影响其和水分子间氢键的形成，从而诱使聚合物的构型发生改变 我们研究小组利用ATRP方法在制备的poly( CMS-co-DVB) 整体柱表面原位接枝PNIPAAm作为色谱固定相［43］，以激素类药物为分析物，考察了盐浓度( 0.05～2.0mol/L) 和盐种类对柱体疏水性质的影响，结果表明: 随着盐浓度的增大，聚合物链表面水化层逐渐被破坏，柱体表面疏水性逐渐增强，使激素的保留能力增加，而盐种类对疏水性质的影响则表现为硫酸钠＞硫酸铵＞氯化钠基于整体柱的盐敏特征，我们［54］以含有硫酸钠的溶液为流动相，在疏水相互作用色谱模式下，实现了6种蛋白质的基线分离 此结果显示出盐敏整体柱在色谱领域的良好应用前景
2．4 多重敏感性整体柱
随着对功能材料研究的深入，单一敏感性材料已无法满足人类对多功能材料的要求，因此，开发多重敏感性材料成为当今这一领域发展的重要趋势目前，除了上述介绍的均聚物( 如同时具有pH敏和盐敏性的聚电解质PDMAEMA及同时具有温敏和盐敏性的PNIPAAm等聚合物) 外，利用不同单体形成嵌段共聚物来赋予材料以多重敏感性是目前制备多功能材料的重要手段 卓仁禧等［55］以BIS为交联剂，制备得到同时具有pH敏和温敏性的含P( NIPAAm-co-AAc) 组分的水凝胶，通过考察不同条件下溶胀率的变化来表征其双重特性，并用于生物大分子的控制释放 在色谱固定相方面，Kanazawa等［56］以甲基丙烯酸丁酯( BMA) 二甲氨基丙基丙烯酰胺( DMAPAAm) 和NIPAAm为单体，在硅球外层共聚交联包裹上一层水凝胶，使其同时具有pH敏和温敏特性，并将此硅球作为色谱填料制备多重敏感性的色谱固定相，用于非激素类抗炎药物的分离分析 随后，该课题组［57］还制备了P( NIPAAmco-tBAAm-co-AAc) 修饰的硅球，用作双重敏感性固定相，用于脑内激素的分离分析 尽管如此，目前对于多重敏感性整体柱的研究还较少 如前所述，我们研究小组近年来不仅制备了同时具有温敏和盐敏性的PNIPAAm修 饰 的poly( CMS-co-DVB) 整 体柱［43，54］，还制备了同时具有pH敏和盐敏性的PDMAEMA修饰的poly( EDMA) 整体柱［50］不过，迄今为止，以多重敏感性嵌段聚合物修饰的整体柱材料还未见报道，因此，有待于研究者们开展进一步的研究

3.结论与展望
本文介绍了基于硅胶整体柱和聚合物整体柱的智能型色谱整体固定相，主要包括温敏整体柱pH敏整体柱盐敏整体柱和多重敏感性整体柱，并回顾了近年来这一领域的发展 智能型整体柱能在外界因素的刺激下产生亲疏水性质的变化，从而实现物质的分离调控，目前主要集中在激素类药物蛋白质及多肽的分离; 该分离过程不仅简单，而且能避免有机溶剂的使用，绿色无污染 尽管如此，这类智能型整体柱也还存在着如下不足: 其一，整体柱表面引入的智能型聚合物比较单一，种类较少; 其次，该类智能型整体柱的应用主要集中在色谱领域，对于其在微分离系统中的应用还有待拓展; 其三，目前智能型整体柱主要用于简单样品的分离分析，对于其在实际生物样品及生物技术中的应用涉及较少 相信着科学技术的发展和研究者们的不懈努力，这些难题都会得到逐一的突破和解决，而智能型整体柱也会随着人们的深入研究，在生命科学医药食品和环境化工领域扮演着越来越重要的角色

这么高深的资料，看不懂。