问题描述:参考国标方法用高效液相色谱测水果中的有机酸,流动相为pH2.7的磷酸氢二钾溶液,流速0.5mL/min,进样量20μL,安捷伦4.6mm×100mm,3.5μm色谱柱,标准品苹果酸、柠檬酸、酒石酸、丁二酸在柱子里保留时间很短,1.5min开始出峰,四种标准品分不开,最多出两个峰。如何提高这四种物质的分离度?
解答:(1
)食品中有机酸通常为含有羧基的小分子酸性有机化合物,在水中以酸根离子态存在,直接分析很难在C
18等反相柱上保留,因此一般需要在流动相中加酸(如三氟乙酸等)或缓冲盐(如NaH
2PO
4等)增加其保留时间,以利于色谱分离。(2
)GB 5009.157-2016
《食品安全国家标准 食品有机酸的测定》中用到的色谱柱是C
18(4.6mm×250mm
,5μm
),该实验用到的4.6mm×100mm
,3.5μm
色谱柱虽然粒径小一些但还没达到超高效色谱柱(一般粒径<2 μm
)规格,而该色谱柱长度100mm
比标准要求的250mm
短很多,因此分离能力可能要比国标上的色谱柱差一些,导致这四种有机酸分离度不好。国标中流动相是0.1%
磷酸溶液(pH
约为2.1
)+
甲醇,该实验为pH=2.7
的磷酸氢二钾(磷酸氢二钾为碱性,应该是磷酸二氢钾),很明显国标流动相pH
更低,这有利于这几种酸更多的呈分子状态以增加其在反相色谱柱C
18上的保留时间,改善分离度。(3
)建议该实验采用更长些的色谱柱(如250mm
),同时要保证该色谱柱有足够强的耐水性(最好能耐受100%
水相),流动相pH
尽量靠近国标的推荐,可借鉴国家标准中所示流动相组成,再根据自己仪器进一步优化。色谱图如图6-27
所示。
图6-27 C18柱分离有机酸的色谱图
1—苹果酸;2—乳酸;3—乙酸;4—马来酸;5—琥珀酸;6—丙酸;7—富马酸
领取更多《实战宝典》请进:http://instrument-vip.mikecrm.com/2bbmrpI