主题：【第十四届原创】水产品中孔雀石绿残留的检测

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avih1981

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农检联合队发表于：2021/09/21 16:36:54 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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水产品中孔雀石绿残留的检测

一、实验目的：

水产品中孔雀石绿用《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》（GB/T 20361-2006）进行检测，需要用酸性氧化铝固相萃取柱和PRS柱做净化柱和萃取用。我们单位在采购小柱前会先做验证，证明精密度与回收率都符合要求，再购买。此次对安谱公司的酸性氧化铝固相萃取柱和PRS柱进行连续一周的试用，精密度与回收率都符合要求，将实验过程及数据分享给大家，也分享一下做如何把方法的回收率、精密度做到最好的方法。

二、实验方法：

（一）主要仪器设备与试剂

1、主要仪器设备

电子分析天平（感量0.0001）、电子分析天平（感量0.01）、高速冷冻离心机、PH计、氮吹仪、超声波清洗机、涡旋混合器、固相萃取装置、安捷伦1260高效液相色谱仪配荧光检测器。

2、试剂

乙腈（色谱纯）、二氯甲烷（色谱纯）、无水乙酸铵（分析纯）、冰乙酸（优级纯）、氨水（分析纯）、硼氢化钾（分析纯）、盐酸羟铵（分析纯）、对-甲苯磺酸（分析纯）、酸性氧化铝（分析纯）。

3、标准品

孔雀石绿标准溶液（100Uug/mL）。中间液浓度20ng/mL,工作液浓度1.00 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、7.00 ng/mL、10.00 ng/mL。

4、其他耗材

酸性氧化铝固相萃取柱（500mg、3 mL）、PRS柱（500mg、3 mL）、0.45um有机滤膜、一次性注射器。
（二）液相色谱条件

色谱柱：安捷伦C18柱4.6mm×100mm,粒度3.5um；流动相：乙腈＋乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L,PH4.5）=80+20；流速1.3mL/min；柱温：35℃；激发波长：265nm,发射波长：360 nm；进样量：20uL。

（三）检验原理

样品中残留的孔雀石绿用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物隐色孔雀石绿，用乙腈＋乙酸铵缓冲溶液提取，二氯甲烷萃取，固相萃取柱净化，反相色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。

（四）样品前处理

称取5.00g样品于50mL离心管中，加入20ng/mL标液100uL，加入15mL乙腈，振荡2 min，加5g酸性氧化铝，振荡2 min，4000r/min离心10min，上清液转移至125mL分液漏斗中。

图1：称样、加标

在分液漏斗中加入2mL二甘醇，2mL硼氢化钾溶液，振摇2 min。在50mL离心管中继续加入2mL硼氢化钾溶液，再加入1.5mL盐酸羟胺溶液，2.5mL对-甲苯磺酸溶液，5.0mL乙酸铵溶液，涡旋2min。再加入10mL乙腈继续涡旋2min，4000r/min离心10min，上清液并入125mL分液漏斗中。重复操作一次。在分液漏斗中加入20mL二氯甲烷，剧烈振摇2min，静置分层一段时间后，将下层溶液转移至100mL茄形瓶中。继续在分液漏斗中加入5mL乙腈、10mL二氯甲烷，振摇2min，把全部溶液转移至50mL离心管，4000r/min离心10min，将下层溶液合并至250mL茄形瓶中。45℃旋转蒸发至近干，用2.5mL乙腈溶解残渣。将PRS柱安装在固相萃取装置上，上端连接酸性氧化铝固相萃取柱。用5mL乙腈活化，转移提取液到柱上，再用乙腈洗茄形瓶两次，每次2.5mL，依次过柱，弃去酸性氧化铝柱，吹PRS柱近干。加3mL等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液，收集洗脱液。乙腈定容至3mL，过0.45um滤膜，供液相色谱测定。

图2：净化、浓缩

三、结果分析及讨论（色谱图，标准曲线，空白基质，加标浓度，回收率等）

1、校准曲线

以孔雀石绿中间溶液配成标准的工作曲线浓度分别为1.00 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、7.00 ng/mL、10.00 ng/mL。以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标做校准曲线，做一校准曲线，线性回归方程为Y=9331.1X-783.56，相关系数R²0.9998。孔雀石绿在1-10ng/mL范围内线性良好。

图3：配校准曲线及校准曲线图

2、精密度试验

在空白蔬菜样品中添加4ug/kg的农药标准溶液做回收试验，0号为空白，1、2、3号为第一批次小柱处理样品，4、5、6号为第二批次小柱处理样品。平行样品的相对相差≤15%，精密度及回收率试验见表1。

样品编号	试样质量m/g	定容体v/mL	上机液体积V3/uL	上机液浓度ng/mL	样品含量ug/kg	实测差(%)	允许差(%)	回收率
0	4.98	3.00	20	未出峰	未检出	／	／	／
1	5.02	3.00	20	6.713	4.01	0.81	≤15	100
2	4.97	3.00	20	6.562	3.96			99
3	4.98	3.00	20	6.552	3.95			99
4	5.01	3.00	20	6.620	3.96	0.73		99
5	4.99	3.00	20	6.582	3.96			99
6	4.98	3.00	20	6.493	3.91			98

表1：精密度及回收率实验结果

图：4部分图谱：

四、讨论实验内容及对安谱SPE小柱的评价

本方法用安谱两个批次的SPE小柱作平行加标比较（第一批次的小柱时间较长，但未过保质期），结果如下：

1、安谱两个批次的小柱，时间较长的那批过小柱偶有堵塞不流的现象，由于中间更换过酸性氧化铝品牌，为了更好的查找原因，两个批次的小柱分别用两个厂家的酸性氧化铝做比较，确定与酸性氧化铝品牌没有关系，与厂家联系后确认是小柱保质期及运输过程中振荡问题。

2、两个批次的小柱在回收率和RSD上区别不大，都可以满足方法要求。

3、在不抽真空条件下，第二批小柱的速度相对更快。SPE小柱最好现用现买，以防放置时间过长影响检测结果。

总体评价是认为安谱的SPE小柱和PRS柱在精密度及回收率上可以满足《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》（GB/T 20361-2006）的要求。

五、实验过程中保证精密度及回收率的要点。

1、称样、加标、振荡后要静置5分钟，确保溶出效果。

2、离心后的上清液转移至125mL分液漏斗中时要注意，不可吸入油脂、酸性氧化铝。

3、弃去酸性氧化铝柱后以及定容前要用剪平头的吸耳球吹PRS柱近干，保证平行和回收率。

4、旋转蒸发时，转速要由慢到快，防止爆沸。旋转蒸发近干要严格控制好，蒸发太快、蒸发温度太高都会导致回收率降低。

5、实验过程中尽量减少转移次数，影响回收率。

6、样品过柱和洗脱时，流速不能太快，否则样品或洗脱液不能与柱子充分接触，导致回收率降低。