主题：【资料】【“仪”起享奥运】宁夏道地药材枸杞子等级质量标准研究

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发表于：2024/08/13 10:33:18 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

基于传统性状鉴别结合现代中药分析手段的综合评价模式用于宁夏道地药材枸杞子等级划分关键指标的辨识和等级质量标准的建立。本草考证和市场调查指导下,将粒径大小、表皮颜色和不完善粒作为外在性状指标;聚焦枸杞子品质评价的全面性和有效性,在水分、灰分、水溶性浸出物、枸杞多糖(Lyciumbarbarum polysaccharide, LBP)和甜菜碱等药典规定指标的基础上,增加枸杞酸(2-O-β-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid, AA-2βG)、玉米黄质双棕榈酸酯(zeaxanthin dipalmitate, ZD)和挥发性醚浸出物为内在质量指标。并通过t检验、相关性分析和主成分分析等数理统计方法,考察不同等级枸杞子外观性状与内在质量的关联,从而进行质量等级的划分和标准的制定,最后从体外细胞水平比较不同等级枸杞子提取物的活性差异。结果表明,枸杞子主要以“粒大色红”为佳;除甜菜碱外,其余指标成分均在表皮颜色鲜红和一等枸杞子中相对偏高;表皮颜色和水分、水溶性浸出物、LBP、AA-2βG和ZD含量之间存在显著相关。综合研究结果和市场流通情况,本研究以枸杞子的粒径大小和表皮颜色为基础,同时引入LBP、AA-2βG、ZD、水溶性浸出物和水分等多指标进一步指导等级划分,建立了外观性状和内在质量关键指标相结合的宁夏道地药材枸杞子等级质量标准,体外细胞活性也初步证实了一等枸杞子具有更为显著的“滋补肝肾”活性,这为枸杞子的质量控制和优质优价的实现提供了实验依据。

材料与方法

仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);ACQUITY UPC2超高效合相色谱(美国Waters公司);WFJ-7200型可见分光光度计仪(上海尤尼柯仪器有限公司);HWS-24恒温水浴锅(上海诚献仪器设备有限公司);Milli-Q Advantage型超纯水系统(美国Millipore公司);BT25S型电子分析天平(德国Sartorins公司);KQ-250DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);数显游标卡尺(北京能克工程有限公司);Thermo HERH CELL 150培养箱和Varioskan Flash全波长酶标仪(美国Thermo Fisher公司);Centrifuge5424 R离心机(德国Eppendorf公司)。

试剂和细胞系

甜菜碱(批号110894-201604;纯度≥99%)、无水葡萄糖(批号110833-201908)购于中国食品药品检定研究院;枸杞酸(批号8030;纯度≥98%)购于上海诗丹德标准技术服务公司;玉米黄质双棕榈酸酯(批号14,UV≥95%)购于法国Extrasynthese公司;色谱级试剂甲醇和乙腈,分析纯试剂甲醇、乙醇、盐酸、氨水、正己烷、乙酸乙酯和氯化胆碱、丙二酸等试剂购于上海国药集团化学试剂有限公司;高纯度CO2(纯度≥99.999%)由上海氯闵气体有限公司提供。DMEM培养基(批号MA0213-Jan-18I)、胰酶(批号MA0232-Mar-30I1)、双抗(批号MA0110-Mar-24I)和CCK-8 (批号MA0218-Jun-15I)等试剂购于上海美仑生物公司;胎牛血清(批号10099-141)购于美国Gibco公司;Hep G2细胞和HK-2细胞购于中国科学院上海生命科学院细胞资源中心,均接种于含10%胎牛血清,1%双抗的DMEM培养基中,置于含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养。

样品

目前共收集枸杞子样品32批,其中20批样品采集于宁夏生产基地,12批样品收集于上海康桥中药饮片有限公司,均来自于宁夏道地产区。上海市中医药国际标准化研究院吴立宏研究员鉴定为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实,标本保存在上海市中医药国际标准化研究院。样品来源及批号见表1。

性状指标测定和等级划分为了更为直观地反映宁夏道地药材枸杞子外观性状特点,本研究基于本草考证和市场调查情况,选择枸杞子50 g粒度、单粒长度和直径以及表皮颜色作为外观性状评价指标。采用圆锥四分法测定每批样品的50 g粒度,同时挑选破碎粒、未成熟粒和尚有使用价值的油果,计算不完善粒质量分数,以上进行双试验取平均值;每批随机挑选20粒枸杞子,用游标卡尺测定长度(顶端至基部)和直径(腹部最宽处)。表皮颜色通过三位志愿者的感官评价,划分为表皮颜色暗红和鲜红两类(分别用数字1、2表示)。基于2020年版中国药典枸杞子项下的性状描述,并以测量数据的前20%作为一等和统货界限,数值均取较为接近的整数值,制定一等和统货枸杞子的分级标准。基于分级标准,在32批药材中挑选不同性状和等级的枸杞子进行后续实验。检查项测定水分按照2020年版中国药典通则0832水分测定法项下第二法(温度80℃)测定;灰分按照2020年版中国药典通则2302灰分测定法项下总灰分测定法测定。浸出物测定

水溶性浸出物和挥发性醚浸出物分别按照2020年版中国药典通则2201项下的热浸法和挥发性醚浸出物测定法测定。

多指标含量测定

LBP含量依据2020年版中国药典枸杞子项下所述方法测定;甜菜碱、AA-2βG和ZD分别按照前期建立的方法测定[20][21][22]。

外观性状与内在质量的关联性分析

采用SPSS Statistics 21软件对枸杞子的内在质量指标数据按照性状和等级分组情况进行t检验分析,并将外观性状数据和质量指标数据进行Person相关性分析。运用Simca 13.0软件,基于表皮颜色的差异对标准化处理后的质量指标数据进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)。

提取物制备

称取研碎的枸杞子(一等和统货各3批)置于烧瓶中,分别加入9倍量纯水和石油醚浸泡30 min后回流1 h,药渣再加7倍量纯水回流1 h,过滤,合并滤液,减压浓缩成浸膏后冻干成粉末即得枸杞子水溶性和醚溶性提取物。称取适量提取物,DMSO溶解配成质量浓度为100 mg·m L-1的母液,实验前用培养基稀释到给药浓度,过0.22μm微孔滤膜除菌。

HK-2细胞保护活性评价

参考相关方法[23]。基于CCK-8试剂检测不同浓度的枸杞子水溶性和醚溶性提取液(5、12.5、25、50、100μg·m L-1)对HK-2细胞活力的影响,以筛选合适的活性评价浓度。然后将处于对数生长期的HK-2细胞以104个/孔(100μL)的密度均匀接种在96孔板中,每组6个复孔,培养24 h后,模型组和给药组加入10μg·m L-1LPS对细胞进行诱导损伤,同时给药组加入相应药物共同培养,对照组加入含1‰DMSO的培养基,24 h后更换为100μL含有10%CCK-8的培养基培养30 min,使用酶标仪检测A450 nm。

Hep G2细胞抑制活性评价

参考相关方法[24]。将处于对数生长期的Hep G2细胞以104个/孔(100μL)的密度均匀接种在96孔板中,每组6个复孔。培养24 h后,给药组加入相应药物,对照组加入含1‰DMSO的培养基,继续培养24 h后更换为含10%CCK-8的培养基培养1 h,使用酶标仪检测A450 nm。

结果1

1 外观性状等级划分

由表1可知,32批枸杞子的50 g粒度范围为271～560,单粒枸杞子的长度范围为9.37～22.52 mm,直径范围3.35～8.94 mm,不完善粒范围为0.87%～3.57%,表皮颜色鲜红和暗红的枸杞子各有6批和26批。同一批枸杞子普遍存在大小不均的现象,50 g粒度无法全面合理表征枸杞子的大小情况,因此将单粒枸杞子的长度和直径作为粒径大小的测量指标。基于上述划分方法,最终将长度≥16.00 mm,直径≥6.00 mm的枸杞子归为大粒径;长度范围为6.00～16.00 mm,直径范围为3.00～6.00 mm为小粒径。同时符合表皮颜色鲜红和大粒径的枸杞子为一等,其余为统货。同时参考现有标准,一等枸杞子的不完善粒要求≤1.00%,统货枸杞子≤3.00%。

按照上述标准,将32批枸杞子以单粒长度直径和表皮颜色作等级划分依据,共划分为53批,其中一等6批,统货47批,相关性状数据见表2。53批样本按照粒径大小可以划分为21批大粒径和32批小粒径枸杞子;按照表皮颜色差异可以分为13批鲜红和40批暗红的枸杞子。以外观性状初步划分的不同等级枸杞子药材将用于后续内在质量的综合评价分析。

2 检查项

53批枸杞子测定结果表明(表2),各批宁夏枸杞子样品水分≤13.00%,总灰分≤5.00%,均符合2020版中国药典要求。

3 浸出物

53批枸杞子测定结果表明(表2),各批宁夏枸杞子样品水溶性浸出物范围为55.29%～75.99%,符合2020版中国药典要求;挥发性醚浸出物范围为0.46%～0.77%。

4 多指标含量测定

53批枸杞子测定结果表明(表2),LBP的含量范围为0.78%～4.02%,其中4批枸杞子(Goji-5-2、Goji-6-1、Goji-7-2、Goji-19-2)中LBP含量低于药典要求的1.8%。甜菜碱的含量范围为0.53%～1.34%,符合2020版中国药典要求。AA-2βG的含量范围为0.30%～1.43%;ZD的含量范围为0.07%～0.35%。

5 外观性状与内在质量的关联性分析

t检验分析结果如表2所示。LBP、AA-2βG、ZD、水溶性浸出物和挥发性醚浸出物的整体含量均在一等枸杞子和表皮颜色鲜红的样本中相对更高,且水分和灰分在这两类样本中相对更低,即一等和表皮颜色鲜红的枸杞子质量相对更好。此外,不同颜色的枸杞子在水分、水溶性浸出物、LBP、AA-2βG和ZD含量中均呈现显著差异性。然而,甜菜碱在统货、表皮颜色暗红和小粒径样本中呈现相对更高的含量,与传统认为的优质枸杞子特征相反。除甜菜碱之外的指标成分在大粒径和小粒径枸杞子之间均不存在显著的差异,但AA-2βG在小粒径枸杞子中整体含量更高。灰分和挥发性醚浸出物的含量在不同等级和性状样本中不存在明显差异。

相关性分析结果(表3)与t检验基本一致,枸杞子的表皮颜色和水分、水溶性浸出物、LBP、AA-2βG和ZD均都存在显著性相关,颜色越鲜红,水分含量越低,其他成分含量越高,枸杞子质量越好。然而AA-2βG和甜菜碱含量与粒径大小指标之间均呈现负相关,这与传统认为的枸杞子“粒大色红者为佳”相悖;此外,灰分和挥发性醚浸出物与外观性状之间不存在显著关联性。

进一步的PCA得分图(图1A)和OPLS-DA得分图(图1C)结果均表明,基于本研究的8个质量指标成分基本可以实现表皮颜色鲜红和暗红的枸杞子的区分。载荷图(图1B)和VIP图(图1D)显示水分、AA-2βG和ZD是主要的差异贡献成分(VIP>1),这表明以上三个成分可以作为枸杞子质量评价的重要指标。