主题：我用同位素示踪法做微生物代谢控制分析，将普通丙酮酸和碳13标记丙酮酸按照1：1比例混合后用finnigan surveyor MSQ 做预试验，发现两种分子

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15N同位素示踪技术在动物蛋白质代谢研究方法中的应用


作者： 文章来源：饲料研究 点击数：1177 更新时间：2003-11-7
15N同位素示踪技术在动物蛋白质代谢研究方法中的应用

高占峰  河北省农林科学院

刁其玉  中国农业科学院饲料研究所



摘要 氮光景是动物营养最重要的元素之一，准确研究蛋白质（氮素）的代谢对于动物饲养标准的修订、饲料原料营养参数的准确性和合注配制日粮具有主要意义。同位素示踪技术在农业中的应用，重点讨论了稳定同位素15N示踪技术在动物营养研究特别是在蛋白质代谢研究申应用的先进性、准确性和可行性。



关键词  同位素  15N示踪  稳定性同位素      动物营养  蛋白质代谢



    原子核中具有相同质子数（中子数不同）的一类核素，由于它们在元素周期表中的位置相同，故称为同位素。自1896年发现天然放射性起，核技术的应用已逾100年。作为一种技术同位素示踪得到广泛的应用，尤其对生物领域研究与发展起到了重要作用，被人们称为“流动型原子显微镜”（商照荣，1995）。同位素示踪技术由于其很高的灵敏度和准确性，因此在农业中的应用极为广泛。国外起步于上个世纪初，1924年，Geogede Hevesy第一次将放射性物质应用于动物研究，直到50年代才被广泛应用。我国始于1956年，近半个世纪以来，得到了迅速发展，在研究深度和广度上也有了较大提高，应用的核素达40多种，同位素标记化合物达140多种。

    根据同位素示踪所标记核素的稳定性和放射性，分为稳定性同位素示综，如15N、13C等和放射性同位责承综，如3H、14C、32P等。其在农业中的应用领域主要是土壤肥料、植物生理、植物营养、生物固氮、生态环境、植物保护、动物生理、动物营养、畜牧兽医、医学及人的营养等方面。作为一种先进的研究工具，解决了许多在基础理论和实际应用方面难以解决的问题，促进了相关学科的发展。

    稳定同位素15N目前在农业上应用最多的领域是土壤肥料、植物营养代谢、生物固氮等。    通过15N示踪方法，研究了作物对氮肥的吸收、运转和代谢规律，为合理施肥，提高肥料利用率提供了科学依据。但15N作为一种先进的工具应用于动物营养研究，特别是在蛋白质代谢方面，仅有少量报道，远没有发挥其应有的作用。近些年来，畜牧业发达国家一直在修订和改进动物饲养标准，这需要大量的代谢研究做基础，而研究方法的先进性直接影响着试验结果的准确性、真实性和可靠性。在蛋白质的代谢研究中，无论是非蛋白氮还是蛋白氮，目前沿用的仍是传统的研究方法。与15N示踪技术相比，存在很多局限性，因此，利用15N示踪技术研究蛋白质的代谢规律，将对动物营养研究产生深远的影响。

1同位素示踪的优缺点

1．l优点

1．1．l灵敏度高。对于放射性同位素，其检出限量为10-15g。而常规的仪器分析最高也只能达到10-12g，因此在动物营养衡量元素、维生素等的代谢研究中具有无可比拟的优越性。

1．1．2  可区分体系中原有和加入的核素，利用同位素具有的放射性（放射性同位素）或不同于天然丰度（稳定性同位素）的特性进行分离。

1．1．3可在机体正常的生理条件下进行。由于标记核素的示踪性，试验过程无须特殊处理。

1．1．4简化操作程序。对于样品的测定，一般无须进行分离，仅测定其放射性或丰度即可。

1．1．5试验结果准确。对于动物营养研究，内源性的影响很难排除，而同位素示踪可大部分或全部排除其干扰。

1．2缺点

1．2．1同位素效应。一般在应用时认为同位素间具有相同的化学性质，实际上同位素之间存在物理或放射化学性质的差异，即同位素效应。对于生物学研究，相对来说，这种差异所引起的误差远小于试验的系统误差，可忽略不计。

1．2．2放射生物学效应。对于放射性同位素，其射线会引起试验对象的生理生化变化，有些同位素还会衰变为其他元素，造成不可预测的影响。

1．2．3放射性污染。射线具有较强的穿透能力，对试验人员造成伤害，代谢产物也会带有放射性，因此，对试验设计剂量和防护要求较高。

2．2．4应用范围限制。并不是所有的元素都适用于做标记物。

1．2．5成本高。同位素价格及所需测定仪器比较昂贵，另外，还是必要的防护。

2稳定同位素示除与放射同位素示踪的比较

    由于稳定同位素和放射同位素核素性质的不同，对其利用的方式也不同，导致二者有所差异，优缺点见表1。

表1稳定同位素示踪和放射同位素示踪的比较


稳定同位素元素
放射同位素示踪

所利用的特性
同位素质量差异
射线

灵敏度
同常规
高

成本
高
高

安全性
安全
不安全

污染
无
有

同位素效应
低
高




3同位素示踪技术在动物营养中的应用现状

    从目前已掌握的资料看，动物营养研究领域所使用的同位素绝大多数是放射性同位素，主要用于研究矿质元素在动物体内的吸收、转移和代谢规律。所使用的核素包括钙、磷、铁、锌、钠、钾、锰、铝、钴、铜、碘、碳、氢等，所涉及的动物包括单胃和反刍动物。如Aruna等（1992）用65Zn研究了山羊日粮中锰含量对锌吸收串的影响；陈颂华等（1991）利用65研究了Zn在黄鳝血液及主要器官中的分布和代谢；陈堆松等（1991）利用55+59Fe研究了蛋氨酸铁饲喂妊母治后向仔猪体内的转移；楼洪章等（1991）利用32P研究了玉米螟精子的转移；Gislason等（1992）用59Fe研究了仔猪补铁的吸收利用；王中华等（2000）应用14C标记的丙酸和葡萄糖研究了不同瘤胃乙、丙酸比例对绵羊丙酸糖异生和葡萄糖周转速度的影响。

    稳定同位素在动物营养中的应用相对较少，所使用的核素主要是15N，其研究目的是研究蛋白质


（氮素）在动物体内的代谢规律。如G．Gebhardt等用15N标记干乳清喂猪，测定消化道中氮的吸收和内源性氛的分泌情况；何电源等（1993）利用15N标记稻草研究N、C在羊体内的转化和作用；邢廷铣等（1995）用15N标记绿肥喂猪，研究氮在猪体内的转化和代谢规律；Dhimen等（1992）用15N研究了体内的尿素循环；邹桂伟等（1994）利用15N研究了轮虫中的氮向链、鳙鱼苗体内迁移规律的研究等。

4稳定同位素15N示踪的优势

    氮素是作物最重要的营养素之一，其始自于肥料氮、土壤氮和氨气，通过作物的同化和异化，形成作物秸秆和籽实的核酸和蛋白质。而作物秸秆和籽实是动物最主要的三大营养素一脂肪、淡水化合物和蛋白质的来源。氮素由于其对动植物体的重要性，被称为“生命元素”，因此，对氮素的研究远比其他元素重要。蛋白质的代过在很大程度上是氮素的代谢。因此准确研究氮素的代谢，会更真实的反映动物对日粮蛋白质的消化、吸收和利用，同时对于饲料原料蛋白质的营养评定及修订和改进动物饲养标准也具有重要的指导意义。另外，随着畜牧业的发展，全球蛋白资源愈显紧缺，一方面，人们在努力寻找新的蛋白资源，另一方面，对于充分利用现有蛋白资源、提高其利用串一直做着不懈的努力，而试验方法的科学性直接影门研究结果的准确性。利用15N 示踪技术研究蛋白质的代谢与常规消化试验方法（全收粪法、指示剂法、尼龙袋法和离体消化试验）相比有以下五方面的优势。

    ①能够分离内源性和日粮蛋白质，从而测定日粮或某一组分的真实消化率。

    ②可在动物正常的生理条件下进行。

    ③研究动物日粮中不同植物蛋白质间的相互作用。

    ④对于反刍动物，研究非蛋白氛，如尿素的代谢规律，科学合理利用非蛋白氮。

    ⑤研究日粮或某一组分蛋白质的瘤胃降解率及降解蛋白质合成瘤胃微生物蛋白的效率。

5．l标记物的制备

    制备15N标记物是示踪试验得以进行的关键。15N的天然丰度（自然界中该核素的原子数占该元素所有同位素原子数的百分比）为0．366 3 ％，标记物的15N丰度理论上可达100 ％。无机氮标记物（或标记氨基酸）可直接购买，如（15NH）2CO、（15NH4）2SO4、15N H4NO3、 NH415NO3、15N H4NO3、（15NH4）2CO3等，丰度可高达90％以上。对于植物蛋白标记物，利用标记肥料，通过种植待试作物进行标记。按一般的施肥方式和数量，禾本科作物籽实的15N丰度（即蛋白质丰度）为标记肥料的50 ％，秸秆为40％，豆科由于其固氮作用，相应的15N丰度略低。收获后，按常规的加工方法即得到标记物，如玉米、豆饼（粕）、棉饼（粕）、菜饼（粕）等。因此，只要是饲料原料来源于作物，都可以按此法进行15N标记。

5．2 15N丰度选择

    标记物适宜的15N丰度选择，可根据目前的研究成果，以最终代谢产物能够准确测定为宜，因为过高的15N丰度会增加试验成本。利用同位素稀释原理，反推所需待试物的15N丰度。

5．3 15N丰度测定

    目前，测定15N丰度主要利用光谱仪和质谱仪。由于光谱仪测定结果误差大，准确性低，因此，主要采用质谱仪。样品首先经K氏法消化，测定粗蛋白（氮×6．25）含量，测定液在微酸性条件下浓缩至lmgN/mL作为质谱仪的待测样品。再在高真空条件下与次澳酸担反应产生N2（2NH4＋＋ 3BrO－＋２OH－→3Br－＋ N2↑十 5H2O）进行测定。

615N示踪在蛋白质代谢研究中的应用

    配合内源或外源指示剂，利用15N示踪技术研究蛋白质的代谢规律，即双标记法。可用于以下几方面的研究。

6．1 非蛋白氮在癌胃的代谢规律

关于反刍动物日粮中添加非蛋白氮的报道很多，其应用效果多以瘤胃微生物蛋白的产量为指标，认为瘤胃微生物蛋白的增加是由于非蛋白红添加的结果，其机制一般解释为增加了可利用氮的细菌数量。固然，添加非蛋白氮会增加瘤胃微生物蛋白，但瘤胃环境是一个复杂的微生态体系，细菌生长，部分利用氨基酸的脱氢为自身提供氮源，部分脱氢为自身提供碳架。那么，添加非蛋白氛是否会反馈抑制细菌的脱氨作用，从而间接保护了氨基酸，相当于为其他细菌、真菌或原虫提供了更多的氨基酸，从而提高瘤胃降解蛋白的效率和增加微生物的总量；如果有这种反馈抑制作用，那么，这种作用有多大？另外，不同日粗蛋白组成对非蛋白氛的利用有无影响？影响多大？采用常规的方法是无法做到的。而利用15N示踪技术可分清瘤胃微生物蛋白多少是由非蛋白氟合成的，多少是由瘤胃降解蛋白合成的，采用不同的添加水平，研究其代谢规律，就会解决这个问题。从而，为合理使用非蛋白氮提供更科学的依据。

6．2饲料蛋白质在瘤胃的降解率

    瘤胃蛋白质降解率是评定反刍动物饲料蛋白质营养价值和确定反刍动物蛋白质需要量的重要参数。因此，瘤胃蛋白质降解率的真实性是非常重要的。目前，评定瘤胃蛋白质降解率的方法主要有活体内法、活体外法和尼龙袋法。这些方法最主要的缺点是不能在瘤胃自然环境下进行，真试验误差必然较大。利用15N示踪和指示剂双标记法（杨凤，1991），便可解决此问题，从而，得到更真实的病日蛋白质降解率及瘤胃降解蛋白转化为微生物蛋白的效

率。

6．3单胃动物蛋白质的真消化率

    对于单胃动物，由于内源性蛋白质的存在，一般只能测定表观消化率，测定其消化率相当困难。同样，利用15N示踪和指示剂双标记法，测定单一饲料成分回肠末端饲料蛋白真消化率，尽管动物吸收后的蛋白经代谢后会有部分标记物转为内源性蛋白质，由于单胃动物排空速度较快，对结果的影响甚微。另外，在饲料原料参数中，所给参数是确定的。而在日粮配制过程中，蛋白原料一般都在两种以上，不同蛋白原料的消化是否存在竞争、协同或额顿，利用此法，还可进行更深入的研究。

    诚然15N示踪技术也有其局限性，如标记物成本及分析费用较高；有些低蛋白原料需要标记的15N 丰度较高；对研究人员的要求也高，需要较好的同位素示踪技术和动物营养学研究基础；15N同位素示踪技术应用于动物营养领域尚处于起步阶段，可能会存在一些问题需要解决。但基于方法的先进性和准确性，随着动物营养研究的进一步深入，15N同位素示踪技术必将得到更广泛的应用。

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