蜂蜜中链霉素残留物的Charm II测定和液相色谱柱后衍生化-荧光检测验证Detection of Streptomycin Residues in Honey Using the Charm II-test and Confirmation of Results through HPLC with Post-column Derivatisation and Fluorescence Detection
引言
自1994年植物保护剂植物抗生素在德国被有严格条件的、暂时的和极为有限的允许用于控制水果的Feurbrand,它已被欧洲的其他一些国家和美国使用了好几年。含有有效成分链霉素的植物抗生素部分用于花期,这导致了蜂蜜中氨基糖苷抗生素的残留。由Usleber等[1]介绍的用于测定蜂蜜中残留的酶化学免疫法测定结果在10~100μg/㎏。但是由于链霉素和双氢链霉素之间高度交叉反应,因此用ELISA法不能说明这两种抗生素的差别。所以需要研究一种有足够灵敏度的方法验证。
HPLC法是在Gerhardt等[2]提出在线富集HPLC测定纤维中链霉素的方法和Usleber等[1]提出的方法基础上提出的。因为当时市售ELISA试剂盒灵敏度不够,基于测定美国Charm Science公司放射受体试验(Charm II 试验)的方法较适合于链霉素检测的筛选。
Charm II-实验
试剂
-CharmII链霉素试剂盒(LD Labor Diagnostika,Heiden)
-MSU 和 M2缓冲液(试剂盒附带)
-玻璃棉,以磷酸处理
样品条件
厂方并未提供蜂蜜样品的处理方法,按材料[3]样品处理方法进行如下处理:
取10g蜂蜜于聚四氟乙烯离心管内,加10mL MSU 缓冲液,在震荡机上震荡10分钟,直至蜂蜜完全溶解。经玻璃棉过滤,以M2缓冲液调滤液pH至7.5。按厂方说明进行测试,不过测试前必须静置1小时以上,以获得恒定的测定值。
分析和讨论
此实验分析是半定量的。每组实验至少有两个浓度在10到30μɡ∕㎏之间的加标样品。通过对于这些阳性控制样品测定值的比较,高于20μɡ∕㎏链霉素的样品就可以得到确认。10到20μɡ∕㎏的测定值也可以清楚地与空白样区分,用这个方法不能确切的测定小于10μɡ∕㎏的链霉素,因为控制样(标样)也会在一定范围内波动。
可以确定,用这种方法测定双氢链霉素也有大致相同的灵敏度。正如ELISA法一样由于双氢链霉素的交叉反应有时结果会大于100%[4,5]。CHARM II法的优点在于样品的制备和实验过程十分简便和快速。只要有所需的仪器设备,与ELISA法相比这种方法更为有效,即使是少量的样品。
HPLC方法
* 译自Lebensmittelchemie 50, 115-117, (1996).
化学试剂和溶液
-用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配制磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH 8);
-0.2mol/L氢氧化钠 (称8g氢氧化钠溶于1L水),按使用要求过滤和脱气。
-pH 2的高氯酸溶液(用水稀释高氯酸)
-醋酸 99.7%
-玻璃棉,以磷酸处理
-阳离子交换柱:苯磺酸-固相柱(SO3H)(Baker3mL,Order No。7090-03)。采用其他牌号时需要在使用前检查回收率。
-C18-固相柱:将500mg C18担体(Flash)(Baker, Order No.7025-00,Batch F 01081)在3mL玻璃柱中用10mL甲醇浸湿然后装填在聚四氟乙烯小管中。采用其他牌号时需要在使用前检查回收率。
-甲醇,正己烷,叔丁基甲基醚(TBME)
-硫酸链霉素()
-庚基苯磺酸水溶液:0.5 mol/L(用Serva 公司 1-庚基苯磺酸钠盐制备)
-HPLC溶液(B):10 mmol/L,pH 3.3(2.02g 1-庚基苯磺酸钠盐溶于水,用乙酸调pH至3.3)
-溶剂系统A:1-庚基苯磺酸(10mmol/L)和1.2-萘醌-4-苯磺酸(0.4mmol/L)的水溶液+乙腈(80+20);用乙酸调pH至3.3;当天新配置(否则会降低灵敏度并升高背景信号)。
-溶剂系统B:乙腈
参比溶液及其配制
母液:100mg链霉素溶于100mL水中(1000μɡ∕mL)
工作液(A):1mL母液溶于100mL水中(10μɡ∕mL)
使用液:2mL工作液溶于10mL水中(2μɡ∕mL):使用前新配制。
外标液:
mL A + mL H2O加10 mL B =μɡ∕mL
0.1 0.9 0.1
0.2 0.8 0.2
0.3 0.7 0.3
0.5 0.5 0.5
配置: 将100μL (150μL, 250μL)使用液加入10ɡ 蜂蜜中,静置5分钟(20,30,50μɡ∕㎏)
样品处理
称取10g蜂蜜于可密封聚四氟乙烯离心管中, 加25mL高氯酸溶液,在震荡器(250/min)上震荡10分钟直至蜂蜜完全溶解。
用阳离子交换柱进行首次净化,用5mL水和2mL高氯酸浸泡。将蜂蜜溶液离心(10分钟,4500 G/min)上清液通过填有玻璃棉的漏斗过滤至备用容器中用于固相萃取,在抽真空条件下通过固相柱。然后用5mL高氯酸溶液清洗漏斗。阳离子交换柱用10mL水清洗,洗脱液和20mL磷酸缓冲液一起放到离心管里。加入2mL 庚基苯磺酸溶液, 滴加磷酸调整pH至2。
为了进一步的净化和浓缩,需用5mL水浸湿已准备好的C18固相柱。为避免堵塞,这根柱子要再离心10分钟(4500 G/min)。再把上清液倒入容器中再慢慢让其流过固定柱。在用10mL水清洗(吸干5分钟)和4mL TBME/己烷(80/20)清洗(吸干5分钟)后为去除残余水分在低真空条件下用6 mL甲醇再洗涤至沉渣瓶。用旋转蒸发器将洗脱液浓缩至很小体积,残余液体用氮气吹干。只要还有残余的水分就要用乙醇在旋转蒸发器上去除。借助于玻璃搅拌器把残渣溶于1mL HPLC溶液中,玻璃部分要以溶剂湿润,把溶液转移到微型样品瓶中。如果不是当天测定样品瓶要冷冻保存。在室温下解冻20-30分钟后按要求离心(4000G/min)
样品制备要点
对于大多数蜂蜜样品可以采用不用阳离子交换柱的简单办法制备。把样品蜂蜜溶于25mL缓冲液(1-庚基苯磺酸 50mmol/L,磷酸钠,25mmol/L,用磷酸调pH至2),按上述步骤离心,过滤,再通过玻璃棉漏斗过C18柱,后续操作同上。
要确证阳性结果,无论如何要增加阳离子交换净化步骤,以便得到干净的基线。特别是色泽很深的蜂蜜,尽管离心和过滤,在2-3小时里还是不能顺利通过离子交换柱。在这种情况下我们建议采取反复处理少量蜂蜜再添加到一起的办法。
液相色谱条件
液相色谱仪 惠普1090 II型
色谱柱: Hypersil BDS C-18
100×4 mm; 3μm(HP)
预柱: ODS 20×2.1mm;
10μm(自填充)
柱温: 40 ℃
进样体积: 100μL
流速: 0.8mL/min
溶剂系统:等梯度操作(98% 溶剂 A+2%溶剂 B)
柱后衍生化
柱后衍生化系统 655A-13型(Merck Hitachi)
试剂: NaOH 0.2 mol/L
流速: 0.4mL/min
温度: 50℃
反应盘管: 长10m, 内径0.33mm(Merck)
荧光测定
荧光检测器HP 1046A
激发波长λex=263nm,发射波长λem=435nm
增益:11