由于提取工艺中采用水为溶剂，其极性大，浸出范围广，选择性较差，药材中的有机酸盐、多糖、蛋白质、苷类、黄酮等均能被浸出，所含与疗效无关的成份较多，使浸膏得率偏高，患者每天所需服用量大，顺应性差，因此采用适当的方法进行纯化。本实验采用醇沉的方法对药液进行纯化，沉淀除去药液中的多糖、蛋白质等杂质，以提高有效成分纯度。采用正交试验的方法考察各因素对醇沉结果的影响，筛选最佳醇沉条件。

仪器与试药

（1）实验仪器

低温冷却液循环泵DLSB-5/20	郑州长城科技工贸有限公司
循环水式多用真空泵SHB -Ⅲ	郑州长城科技工贸有限公司
旋转蒸发仪RE-2000	上海亚荣生化仪器厂
低速多管离心机LXJ-ⅡB	上海飞鸽电器厂

（2）实验试药

无水乙醇 (AR)

国药集团化学试剂有限公司

泡腾片醇沉工艺条件的研究

醇沉正交试验筛选

称取药材藤茶、葛花、青果、甘草各0.5倍处方量，共1份，按“1.2.1”项所筛选的最佳提取工艺A3B1C3，即20倍量水、提取0.5h、提取3次，合并3次提取液，分成9份，每份350 ml，以提取液浓度（A），含醇量（B），醇沉时间（C）为考察因素，按表5的因素水平进行L9(34)正交试验，并以总黄酮提取量、干浸膏得率为评价指标，考察最佳醇沉工艺条件。

醇沉浸膏得率的测定

精密量取上述醇沉后药液5 ml，参照“1.2.1.1”项下的方法测定浸膏得率，结果见表6。

醇沉后总黄酮的含量测定

对照品溶液的制备：对照品溶液的制备：称芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释至每1 ml含0.2 mg的芦丁溶液，制得对照品溶液。

供试品溶液的制备：取上述9份醇沉后药液各1 ml，置50 ml容量瓶中，并用水稀释至刻度。

芦丁对照品标准曲线制备：芦丁对照品标准曲线制备：精密吸取芦丁对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml，分别置25 ml（V3）量瓶中，加水至6 ml，加入1 ml的5% NaNO2，混匀，放置6min，往容量瓶里加入1 ml的10%Al(NO3)3，混匀后静置6min，加入10 ml NaOH试液，混匀，加蒸馏水至刻度，混匀，静置15分钟，以0.0 ml对照品溶液制备的溶剂为空白对照，在510nm波长下测定各组的吸光度值。以吸光度为纵坐标(A)，浓度为横坐标（mg/ml），绘制标准曲线, 结果见图2.

样品测定：精密吸取精密吸取供试溶液8 ml（V2），至25 ml量瓶中，照“1.2.1.2”自“加入5%亚硝酸钠溶液1 ml”起，在波长510nm处分别测定吸收度值，从标准曲线上读出供试品溶液中含总黄酮的浓度(C)，计算样品中总黄酮的含量（X）。

计算方法：参照“1.2.1.2”项下的计算方法进行计算。结果见表6，表7.

图2 芦丁标准品标准曲线

表5醇沉正交试验因素水平表

水平	因素
水平	A药液相对密度	B含醇量(%)	C醇沉时间(h)
1	1.0035-1.0039	60	16
2	1.0009-1.0016	70	20
3	0.9959-0.9965	80	24

注：以D因素为误差项

采用加权平均法对浸膏得率、总黄酮含量进行综合评分，由于含量对泡腾片疗效的影响较大，因此，分别给予浸膏得率、总黄酮含量40%、60%的权重进行分配。浸膏的率越高，患者最终单次的给药量越多，宜越低越好，故以最低得率18.68%为最高得分，而总黄酮为主要有效成份，宜越高越好，故以1.625为最高得分。以序号1为例计算综合评分：(18.680/28.002)*0.4+(1.190/1.625)*0.6=0.706，同理，可求得其余各综合评分，结果见表6.

表6醇沉正交试验结果（n=9）

序号	A	B	C	D	浸膏得率(%)	总黄酮含量(g)	综合评分
1	1	1	1	1	28.002	1.190	0.706
2	1	2	2	2	18.680	0.863	0.719
3	1	3	3	3	27.900	1.143	0.690
4	2	1	2	3	30.799	1.405	0.761
5	2	2	3	1	30.447	1.370	0.751
6	2	3	1	2	28.441	1.313	0.747
7	3	1	3	2	32.887	1.592	0.815
8	3	2	1	3	31.601	1.582	0.820
9	3	3	2	1	31.258	1.625	0.839
K1	2.11	2.28	2.27	2.30
K2	2.26	2.29	2.32	2.28
K3	2.47	2.28	2.26	2.27
R	0.12	0.00	0.02	0.01

表7 醇沉正交试验方差分析

方差来源	离差平方和	自由度	F值	均方	显著性
相对密度	0.02185	2	205.2415	0.01093	**
含醇量	0.00003302	2	0.3101	0.00001651
醇沉时间	0.0007093	2	6.6615	0.0003547
误差	0.0001065	2	1.0000	0.00005324

由表7可知，以总黄酮含量与水提取液浸膏得率为评价指标，各因素对结果的影响大小为：药液相对密度>醇沉时间>含醇量，即主要影响因素是药液相对密度，其次是醇沉时间，含醇量影响最小。以实验结果为参考，结合实际生产情况，最终确定醇沉工艺为：药液相对密度为0.9959-0.9965，含醇量70%，醇沉时间20h。

醇沉正交验证实验

根据以上所选最佳醇沉工艺条件，相对密度为0.9959-0.9965，含醇量70%，醇沉时间20h，平行3份，对醇沉后药液的浸膏得率与总黄酮含量进行测定，按2.2.1.2项下的方法计算综合评分后，求平均得分，结果见表8.

表8醇沉正交实验验证结果（n=3）

编号	浸膏得率(%)	总黄酮含量(g)	综合评分	平均得分
1	27.9	1.780	0.925	0.918
2	28.4	1.757	0.911
3	28.4	1.776	0.918

由表8可知，最佳醇沉工艺的平均得分0.918，大于正交设计中的各项综合评分，且评分最高，有较高的准确率，所筛选的醇沉工艺条件基本稳定，可作为藤青泡腾片的醇沉方法。

小结与讨论

通过正交实验，确定最佳醇沉工艺为：将药液浓缩至相对密度为0.9959-0.9965，含醇量70%，醇沉时间20h。醇沉正交试验过程中，各实验组尽可能采用同一批次的提取液，以排除提取因素对结果的影响，且提取液放置过程会有少许沉淀，取样时应先混匀；测定相对密度时，要待浓缩的药液冷却至室温后再测，因高温会是玻璃比重瓶体积变大，导致结果不准确；加入乙醇的过程中，乙醇的滴加速度以及搅拌速度应当一致，到醇沉时间后，及时分离出沉淀物并用旋转蒸发仪回收乙醇。