主题：【分享】高效液相色谱技能篇|关于外标法的小知识

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发表于：2024/09/06 14:26:26 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

高效液相色谱（HPLC）中外标法是一种常用的定量分析方法，其基本概念是通过测量已知浓度的标样（外标）和未知浓度的样品的色谱峰面积或峰高，从而计算出样品中目标物质的浓度。一般分为外标单点法和外标曲线法，现在对不同国家的外标法进行对比。 01.中国药典中的外标法（2025版的公示稿） 1）外标法的一般步骤：（可以理解为外标法） a.按照各品种项下的规定，精确称取或量取对照品和供试品，配制成溶液； b.分别精确量取对照品溶液和供试品溶液的一定体积，进行色谱分析； c.记录色谱图，并测量待测物质的峰面积（或峰高）； d.使用公式 C_X=C_R×A_X/A_R计算含量，其中 C_X是供试品中待测物质的浓度，C_R是对照品的浓度，A_X是供试品溶液中待测物质的峰面积（或峰高），A_R是对照品溶液中待测物质的峰面积（或峰高）。 2)对于成分复杂或待测成分含量变化较大的药物体系，可以采用外标标准曲线法进行含量测定。 a.精确称取适量的对照品，或从对照品储备液中精确量取，配制成不同浓度的系列溶液； b.精确量取这些系列溶液，进行色谱分析，记录色谱图，并测量峰响应； c.利用峰响应（或经转换）对浓度绘制标准曲线，并通过最小二乘法计算出回归曲线方程； d.在相同的色谱条件下，精确量取供试品溶液，进行色谱分析，记录色谱图，并测量待测成分的峰响应； e.根据待测成分的峰响应（或经转换）和回归曲线方程，确定供试品溶液中待测成分的含量。简单理解就是做一条标准曲线，得出标准曲线方程，再将待测品的峰相应代入方程进行计算，得出样品浓度。 02.欧洲药典中的外标法 1）多点校准（使用校准函数）： a.准备一系列含有不同梯度浓度的对照品溶液，这些浓度应该在已经证明可以得到线性响应的范围内； b.取固定体积的这些对照品溶液进行色谱分析； c.通过色谱图得到峰面积或峰高，并以此绘制校正曲线，横坐标是对照品的量，纵坐标是峰面积或峰高； d.通常通过线性回归得到校准函数； e.按照各论中规定的程序准备待测样品溶液； f.在与制备校准函数相同的操作条件下进行色谱分析； g.测量待测组分的峰面积或峰高，并根据校准函数读取或计算组分的含量； 2）单点校准： a.在各论中，通常选择一个校准曲线线性范围内的对照品溶液，以及一个浓度接近该对照品溶液的待测样品溶液； b.在固定条件下进行色谱分析，通过比较得到的响应来定量分析组分的含量； c.在这种方法中，所有操作步骤，如进样程序，都必须在恒定条件下进行

图1.欧洲药典原文描述 03.美国药典中的外标法 1）校准函数法（多点校准）： a.制备一系列含有不同浓度的对照品标准溶液，这些浓度应在已知能够产生线性响应的范围内； b.取固定体积的这些标准溶液进行色谱分析，并注射到色谱系统中； c.通过色谱图得到的峰面积或峰高，绘制校准曲线，横坐标是对照品的量，纵坐标是峰面积或峰高； d.通常通过线性回归方法得到校准函数； e.根据各论中规定的程序制备待测样品溶液； f.在与制备校准函数相同的色谱条件下分析样品，测量待测组分的峰面积或峰高； g.通过校准函数计算出样品中待测组分的含量。 2）单点校准法：a.在各论中，选择一个浓度在线性范围内的标准溶液，以及一个浓度接近该标准溶液的待测样品溶液； b.在固定条件下进行色谱分析，通过比较得到的响应来定量分析组分的含量； c.这种方法中，所有操作步骤，包括进样程序，都必须在恒定条件下进行，以确保分析结果的一致性

图2.美国药典原文描述 总结一下：1）中国药典提供了外标法的一般步骤和标准曲线法的详细描述，但没有明确描述单点校准法。 2）欧洲药典和美国药典都详细描述了多点校准和单点校准的方法，并且强调了所有操作步骤需要在恒定条件下进行。（这两家基本是一致的描述） 3）三种药典都强调了在色谱分析中保持操作条件的一致性，以确保分析结果的准确性和重现性

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