气相色谱—质谱法确证胆汁中1,2—二苯乙烯类药物(EEC,确证法)STILBENES-CONFIRMATION OF STILBENES IN BILE BY GAS CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY
(EEC,CY1.3 CONFORMING METHOD)
安全操作注意事项及急救——当使用氨做化学电离时,确保在系统中无泄漏,并且适当通风,若感觉不适,离开房间,呼吸新鲜空气。
0 引言
目的
对来自饲养动物样品的胆汁中存在的1,2—二苯乙烯类药物化合物进行确证和鉴别。此项工作符合残留指令(86/469/EEC)要求。
背景
由于1,2—二苯乙烯类药物施用于动物能达到促进生长的目的,而被进行监督管理。通常使用三种1,2—二苯乙烯类药物:己烯雌酚(dethylstiboestrol,即DEC),己烷雌酚(dienoestrol,即DE)和双烯雌酚(hexoestrol,即HEX)。
在1981年,1,2—二苯乙烯类生长促进剂的施用在整个EEC被禁止。在符合残留指令(86/469/EEC)的执行国际监督计划(National Surveillance Scheme)所进行的监控下,监控这些化合物在屠宰动物中的存在。
1 主题内容
从1988年1月1日起实施,整个EEC禁止使用促生长激素,为确证饲养场不继续使用1,2—二苯乙烯类药物,把屠宰时的胆汁做为样品,并用放射免疫技术筛选鉴别这些化合物是否存在。如果是阳性筛选结果,则必须做确证。在英国使用
气相色谱-质谱法进行确证。
2 应用范围
在英国,该法被用于确证阳性胆汁样品中1,2—二苯乙烯类药物的存在。胆汁中己烯雌酚检测限(DEC)为5μg/L,己烷雌酚(Hexoestrol)为1μg/L。
3 参考资料
Commission Decision, 93/256/EEC,laying down the methods for detecting residues of substances having a hormonal or thyrostatic action.〔OJ.No.L.118,14.4.93.pp 64-74〕
ISO Standard 78/2-1982 Layout for Standards -Part 2:Standard for Chemical Analysis
CVL(1990) Standard operating procedure for Confirmation of stilbenes in bile by GC-MS. 27th June 1990.
Bates,M.L., Warwick, N.J. and Shearer, G.(1985),Determination of synthetic growth promoters in bile. Food Additives Contaminants. 2, 37-46
Covey,T.R.,(1985), Quantitative secondary ion monitoring gas chromatography/mass spectrometry of diethylstilbestrol in bovine liver. Biomed. Mass Spectrometry,12,
Day, E.W., Vanatta, L.E. and Sieck, R.F.(1975), The confirmation of diethylstilbestrol residues in beef liver by gas chromatography-mass spectrometry. J.A.O.A.C. 58, 520-527
Van Peteghem, C.H., Lefevere,M.F. Van Haver, G.M. and De Leenheer, A.P.,(1987).Quantification of diethylstilbedtrol residues in meat samplesby gas chromatography-isotope dilution mass spectrometry. J.Agric. Food Chem. 35,228-231.
4 定义
1,2-二苯乙烯类药物含量是指待测物中1,2-二苯乙烯类药物的量,不论其化学形态,按所述方法测定并用1,2-二苯乙烯类药物μg/L试样表示。
5 方法提要
分析方法包括六个步骤:
(1)胆汁过夜水解
(2)Extrelut柱净化
(3)双Bond-Elut柱进一步净化
(4)衍生化
(5)衍生化后净化
(6)
气相色谱—质谱分析
6材料
6.1 葡萄糖苷酸(Glucuronidase 〕 Boehringer BCL(Cat No.127051)
6.2 二氯甲烷 Fisons Distol级(苯胺作稳定剂)
6.3 乙醚 Fisons Distol级
6.4 石油醚 Fisons Distol (40-60℃馏份)
6.5 甲醇 Fisons Distol级
6.6 七氟丁酸酯(Hetafluorobutyrate)(HFBA) Phase Sep Ltd(Cat No 940851)
6.7 Extrelut柱 Merck BDH
6.8 Bond-Elut柱 500mg 氰基,Jones Scientific(Cat No 613303)
6.9 Bond-Elut柱 500mg 氨基,Jones Scientific(Cat No.611303)
6.10磷酸盐缓冲液 pH7 (0.06mol/L)〔3.3g Na2HPO4+5.75g NaH2PO4配成1升〕
6.11磷酸盐缓冲液 pH6 (1.0mol/L)〔35g Na2HPO4+3g NaH2PO4配成1升〕
6.12己烷 Distol 级
6.13庚烷 Distol 级
6.14全氟三丁胺( Perfluorotributyamine) Finnigan MAT
6.15标准
己烯雌酚(DES)
己烷雌酚(Hexoestrol)
双烯雌酚(Dienoestrol)
用甲醇配制成浓度1mg/mL,然后稀释成浓度为10μg/mL,1μg/mL, 100ng/mL,10ng/mL和1ng/mL的工作标准。
7 仪器设备
7.1 多用瓶 20mL
7.2 Techni Dri-加热块
7.3 Quick-fit管 50mL(MF-24)
7.4 Quick-fit expansion 接头 (34/35-24/29)
7.5 密封盖试管 J Bibby(Cat No.5142-10)
7.6 水浴
7.7歧管(manifold) 供给无氧氮气
7.8
气相色谱小瓶及盖
7.9质谱 Finnigan MAT,与
气相色谱及INCOS数据系统连接。
8 样品和样品制备
此节是根据6.3.3节和国际标准化组织(ISO)有关文件(ISO78/2—1982(E))内容起草的,如下注意事项源于2052/VI/84—EN的附录Ⅱ。
8.1样品特性:样品应符合64/433/EEC指令中所规定的测定肉中残留物的要求。如果不能得到肉样,生物液体(该法中为胆汁)或粪便可作为测定残留物的替代样品。
8.2样品量:样品量必须足以完成本方法测定,并足以进行所需要的重复分析。
本法用5mL胆汁测定1,2—二苯乙烯类药物,样品应不少于20mL胆汁。
8.3样品的扦取和包装应便于实验室鉴别。
8.4包装、存放及传递方法必须保持样品的完整性,不能对检测结果产生不利的影响。
用于测定1,2—二苯乙烯类药物的样品,必须在低于—18℃温度下保存和传递。