九、超高效液相色谱的优点1、超高分离度色谱工作者正面临分离十分复杂混合物的挑战,如肽的消解产物、杂质及体内代谢物样品等。为了使分离能完全优化就需要一个超高性能的色谱系统。这样一个系统理想地应符合
液相柱色谱的基本原理。根据等度
液相色谱分离的分离度(Rs)方程,分离度(Rs)与柱效(N)的平方根成正比。
按Van Deemter色谱理论,柱效(N)与颗粒度(dp)成反比:
故:随着dp的降低,N值会增加;而N值增加,则Rs值增加。HPLC与UPLCTM的基本分离理论,进一步说明了颗粒度大小和分离度密不可分的关系。
ACQUITY UPLC系统发挥了1.7μm颗粒提供柱效增高的全部优越性。尤其是1.7 μm颗粒提供的柱效比5 μm颗粒提高了3倍。因为分离度与粒度的平方根成反比,1.7μm颗粒的分离度比5 μm颗粒提高了70%。在梯度分离中也具有同样的优越性,此时分离能力用峰容量衡量。
UPLC用1.7μm颗粒提高了分离能力,可以分离出更多的色谱峰,从而对样品提供的信息达到了一个新的水平。而且又最大地缩短了开发方法所需的时间。
2、超高速度高通量实验室始终要求在单位时间内提供更多的信息和处理更多的样品并保证提供高质量的数据。较小的颗粒能超乎寻常地提高分析速度而不降低分离度。因为颗粒度减小后,柱长可以按比例缩短而保持柱效不变(
),而且Van Deemter理论表明最佳流速与粒度成反比(流量∝1/dp)。柱长缩短会加快分离速度,而颗粒度越小,最佳流速也越大,进而可以通过提高流速来进一步加快分离速度。
由于ACQUITY UPLC系统用1.7 μm颗粒,柱长可以比用5 μm颗粒时缩短3倍而保持柱效不变,而且使分离在高3倍的流速下进行,结果使分离过程快了9倍而分离度保持不变。
UPLC的快速分析亦节省了以往一向耗时的方法认证的时间,使方法认证的变得简单快速。用户不必担心因HPLC转换成UPLC带来的方法认证负担。
原有HPLC分析需要4个不同的方法、三根不同的色谱柱,至少需要65分钟才能完成;UPLCTM使用了一根色谱柱、一种简单方法,在1分钟内即可完成。
3、超高灵敏度过去几年中,提高灵敏度的工作集中在检测器上,包括光学检测器和质谱检测器。这种趋势主要是受要求检测化合物的浓度越来越低(如高效药物)的驱动。然而采用超高性能色谱系统就能获得灵敏度的显著提高。
在UPLC中始终可得到较高的灵敏度。UPLC使用小颗粒技术可以得到更高的柱效(因而改善了分离度)、更窄的色谱峰宽(N∝1/W
2),即更高的灵敏度。
因为色谱峰变得更窄,峰高也就更高了(峰高∝1/W);同样,当UPLCTM用于快速分析、用较短色谱柱而使柱效不变时,色谱峰高会相应增加 (峰高∝1/L)。因此,使用UPLC技术,不仅可以在在保持与HPLC相同分离度时提高峰高,而且在改善分离度的同时亦可提高峰高即灵敏度。
4、简单方便的方法转换UPLC与HPLC基于相同的分离机理,故相互之间的方法转换非常容易和方便。现有HPLC方法可以按照比例直接转换成UPLC方法;相反,UPLC方法也很容易可以转换成HPLC方法供常规HPLC系统使用。