固相萃取，高效液相色谱法直接测定饮料中的改性胭脂虫红

【生活中的仪器分析】食品安全——饮品卫生大检测

胭脂虫红是提取于雌性胭脂虫的一种蒽醌类天然动物色素，我国食品添加剂使用卫生标准GB2760-2011规定：胭脂虫红（以胭脂虫红酸计）可用于碳酸饮料，最大使用量为0.6g/Kg,配制酒最大使用量0.25g/Kg，冷冻饮品最大使用量0.15g/Kg。对胭脂虫红酸的测定研究，国内有福建省产品质量检验研究院的林钦,陈永煊等^（1），广州分析测试中心的喻凌寒等^（2），北京联合大学应用文理学院的丁靖等^（3），上海市质量监督检验技术研究院的虞成华^（4）等，中国林业科学研究院资源昆虫研究所的郭元亨^（5）等。而作为商品应用的胭脂虫红，通常是经过改性的，是一种水溶性钙铝色淀。本文对此种钙铝色淀进行检测研究，并与胭脂虫红酸检测进行比较。
1 实验部分
1.1仪器与材料
Agilent Technologies 1260 高效液相色谱仪,
色谱柱：ZORBAX SB-C18 StableBond Analytical 4.6*150mm 5-Micron
Agilent Technologies 6530 Accurate-mass Q-TOF LC/MS,
色谱柱：CNW.Athena UHPLC C18 2.1mm×100mm.1.8um. ANPEL,P/N LAEO-2110uA
固相萃取柱：用100-200目聚酰胺粉自制，迪马ProElut PLS 500mg 6ml。
改性胭脂虫红液体样品：广州市威伦食品有限公司提供，自制改性胭脂虫红标准品：经低温（50度）减压干燥制备。
1.2实验过程
1.2.1 固相萃取适用范围
适用于水性饮料中胭脂虫红色素的测定。
1.2.2提取
吸取5mL饮料，200uL甲酸于试管中摇匀，作上样液待净化。
1.2.3净化
聚酰胺固相萃取小柱制作：取3mL的固相萃取用空柱，下端放些脱酯棉，将75-150um的聚酰胺粉加入甲醇成浆状，湿法装填，上用玻璃棒压实后聚酰胺填料厚度约为2cm。
a活化：2mL酸化甲醇（500mL甲醇+10mL甲酸）和2mL水淋洗活化。流出液弃去；
b上样：将待净化液加入小柱，流出液弃去；
c淋洗：5mL水溶液，流出液弃去，将小柱抽干；
d洗脱：5-10mL1%氨水/甲醇（1:1）溶液洗脱至无色，收集流出液，2%甲酸/甲醇溶液调至中性
e重新溶解：40度下将洗脱液减压蒸馏(或氮吹)至近干，用50%甲醇水溶液溶解并定容至1mL，用0.2umPTFE滤膜过滤后HPLC分析
1.2.4色谱条件
流速：1.0mL/min
进样量：10uL
柱温：30度
检测器：UV510nm
流动相：A:0.05mmol/L乙酸铵，B:甲醇

梯度设置

时间/min	0	2	7	7.5	10
A	90	80	25	90	90
B	10	20	75	10	10

1.2.5添加回收结果
将标样以50%甲醇（色谱纯）配制成适当浓度的溶液，将该溶液1mL加入到4mL果汁饮料中，进行净化测定。
胭脂虫红回收率计算：

项目	浓度（ug/mL)	六次测定平均值	回收率%	相对标准偏差%
加标1	112	98.3	87.8	10.2
加标2	224	206.5	92.2	8.3
加标3	1120	1071.2	95.6	4.5

可见在上述浓度范围内线性很好
使用迪马固相萃取柱：回收率仅在50%左右。
改性胭脂虫红色谱图

改性胭脂虫红吸收光谱图

由图可见在紫外区最高吸收峰在280nm左右，在可见光区在510nm左右有最高吸收，在550nm左右有次高吸收，为避免杂质干扰取510nm进行测定。
1.2.6质谱验证
质谱条件：经优化的Q-TOF质谱条件如下：Gas Temp :300℃,Drying Gas :8L/min,Nebulizer :45psig,SheathGas Temp :350℃, SheathGasFlow:11L/min, Vap:4000V, Capillary:0.059Ua, Frag:130V, Skimmer:65V, OCT .IRFVpp:750V. Esi Vcap 4000V Capillary :0.447uA,Chamber :16.37uA Nozzbe Voltage:1000V
改性胭脂虫红Q-TOF质谱图如下

胭脂虫红 (改性）分子式C44H43O32CaAl CAS1260-17-9 C₂₂H₂₀O₁₃分子量492.3864

洋红酸 CAS1260-17-9 C₂₂H₂₀O₁₃分子量492.3864
经研究推断：改性胭脂虫红由二份洋红酸+CaO,+Al(OH)_3,+O₂生成（492.4*2+56+78+32=1150.8）
改性胭脂虫红质谱母离子形成：C₄₄H₄₃O₃₂CaAl----- -Ca,-Al,-H2O=C44H41O31[精确质量为1065.163]
改性胭脂虫红二级质谱则继续脱水生成C44H39O30[精确质量为1047.153],谱图如下

2.与胭脂虫红酸（洋红酸）比较讨论
比较胭脂虫红酸（同浓度酸处理改性胭脂虫红获得）及改性胭脂虫红的3D吸收光谱如下
胭脂虫红酸-3D

胭脂虫红-3D(改性)

由图可见：改性胭脂虫红虽然增加了钙铝水等“杂质”，却有效提高了在可见光区的吸收强度，在色素使用中提升了强度或着色力，研究表明：改性胭脂虫红的强度提升在一倍以上（折算成胭脂虫红酸为46%），色光红移明显，提高了应用价值，同时通过改性（填加水溶性分散剂）增加了其水溶性，方便了使用。
参考文献
【1】林钦，分析试验室，2011.VOL.30.NO.8 陈永煊，福建轻纺，2011.VOL.1
【2】喻凌寒，苏流坤，牟德海，分析测试学报，2008.VOL.27.NO.6
【3】丁靖，惠伯棣，宫平，等，食品科技，2011.VOL36.2
【4】虞成华，陆志芸，朱伟，等，理化检验-化学分册2012.VOL.48
【5】郭元亨，马李一，郑华，等，广东农业科学，2011.VOL.2

附件：

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