主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之三十一）

气相色谱—质谱法确证胆汁中1,2—二苯乙烯类药物（EEC，确证法）
STILBENES－CONFIRMATION OF STILBENES IN BILE BY GAS CHROMATOGRAPHY－MASS SPECTROMETRY
（EEC，CY1.3 CONFORMING METHOD）

安全操作注意事项及急救——当使用氨做化学电离时，确保在系统中无泄漏，并且适当通风，若感觉不适，离开房间，呼吸新鲜空气。

0 引言

目的
对来自饲养动物样品的胆汁中存在的1,2—二苯乙烯类药物化合物进行确证和鉴别。此项工作符合残留指令(86/469/EEC)要求。
背景
由于1,2—二苯乙烯类药物施用于动物能达到促进生长的目的，而被进行监督管理。通常使用三种1,2—二苯乙烯类药物：己烯雌酚(dethylstiboestrol，即DEC)，己烷雌酚（dienoestrol，即DE)和双烯雌酚（hexoestrol，即HEX)。
在1981年，1,2—二苯乙烯类生长促进剂的施用在整个EEC被禁止。在符合残留指令(86/469/EEC)的执行国际监督计划(National Surveillance Scheme)所进行的监控下，监控这些化合物在屠宰动物中的存在。

1 主题内容

从1988年1月1日起实施，整个EEC禁止使用促生长激素，为确证饲养场不继续使用1,2—二苯乙烯类药物，把屠宰时的胆汁做为样品，并用放射免疫技术筛选鉴别这些化合物是否存在。如果是阳性筛选结果，则必须做确证。在英国使用气相色谱-质谱法进行确证。

2 应用范围

在英国，该法被用于确证阳性胆汁样品中1,2—二苯乙烯类药物的存在。胆汁中己烯雌酚检测限(DEC)为5μg/L，己烷雌酚(Hexoestrol)为1μg/L。

3 参考资料

Commission Decision, 93/256/EEC,laying down the methods for detecting residues of substances having a hormonal or thyrostatic action.〔OJ.No.L.118,14.4.93.pp 64-74〕
ISO Standard 78/2-1982 Layout for Standards -Part 2:Standard for Chemical Analysis 
CVL(1990) Standard operating procedure for Confirmation of stilbenes in bile by GC-MS. 27th June 1990.
Bates,M.L., Warwick, N.J. and Shearer, G.(1985),Determination of synthetic growth promoters in bile. Food Additives Contaminants. 2, 37-46
Covey,T.R.,(1985), Quantitative secondary ion monitoring gas chromatography/mass spectrometry of diethylstilbestrol in bovine liver. Biomed. Mass Spectrometry,12,
Day, E.W., Vanatta, L.E. and Sieck, R.F.(1975), The confirmation of diethylstilbestrol residues in beef liver by gas chromatography-mass spectrometry. J.A.O.A.C. 58, 520-527
Van Peteghem, C.H., Lefevere,M.F. Van Haver, G.M. and De Leenheer, A.P.,(1987).Quantification of diethylstilbedtrol residues in meat samplesby gas chromatography-isotope dilution mass spectrometry. J.Agric. Food Chem. 35,228-231.

4 定义

1,2-二苯乙烯类药物含量是指待测物中1,2-二苯乙烯类药物的量，不论其化学形态，按所述方法测定并用1，2-二苯乙烯类药物μg/L试样表示。

5 方法提要

分析方法包括六个步骤：
(1)胆汁过夜水解
(2)Extrelut柱净化
(3)双Bond-Elut柱进一步净化
(4)衍生化
(5)衍生化后净化
(6)气相色谱—质谱分析

6材料

6.1 葡萄糖苷酸（Glucuronidase 〕 Boehringer BCL(Cat No.127051)
6.2 二氯甲烷 Fisons Distol级(苯胺作稳定剂)
6.3 乙醚 Fisons Distol级
6.4 石油醚 Fisons Distol (40-60℃馏份)
6.5 甲醇 Fisons Distol级
6.6 七氟丁酸酯（Hetafluorobutyrate）(HFBA) Phase Sep Ltd(Cat No 940851)
6.7 Extrelut柱 Merck BDH
6.8 Bond-Elut柱 500mg 氰基,Jones Scientific(Cat No 613303)
6.9 Bond-Elut柱 500mg 氨基，Jones Scientific(Cat No.611303)
6.10磷酸盐缓冲液 pH7 (0.06mol/L)〔3.3g Na2HPO4+5.75g NaH2PO4配成1升〕
6.11磷酸盐缓冲液 pH6 (1.0mol/L)〔35g Na2HPO4+3g NaH2PO4配成1升〕
6.12己烷 Distol 级
6.13庚烷 Distol 级
6.14全氟三丁胺（ Perfluorotributyamine） Finnigan MAT
6.15标准
己烯雌酚(DES) 
己烷雌酚(Hexoestrol)
双烯雌酚(Dienoestrol)
用甲醇配制成浓度1mg/mL，然后稀释成浓度为10μg/mL，1μg/mL, 100ng/mL，10ng/mL和1ng/mL的工作标准。

7 仪器设备

7.1 多用瓶 20mL
7.2 Techni Dri-加热块
7.3 Quick-fit管 50mL(MF-24)
7.4 Quick-fit expansion 接头 (34/35-24/29)
7.5 密封盖试管 J Bibby(Cat No.5142-10)
7.6 水浴
7.7歧管(manifold) 供给无氧氮气
7.8气相色谱小瓶及盖
7.9质谱 Finnigan MAT，与气相色谱及INCOS数据系统连接。

8 样品和样品制备

此节是根据6.3.3节和国际标准化组织(ISO)有关文件(ISO78/2—1982(E))内容起草的，如下注意事项源于2052/VI/84—EN的附录Ⅱ。
8.1样品特性：样品应符合64/433/EEC指令中所规定的测定肉中残留物的要求。如果不能得到肉样，生物液体(该法中为胆汁)或粪便可作为测定残留物的替代样品。
8.2样品量：样品量必须足以完成本方法测定，并足以进行所需要的重复分析。
本法用5mL胆汁测定1,2—二苯乙烯类药物，样品应不少于20mL胆汁。
8.3样品的扦取和包装应便于实验室鉴别。
8.4包装、存放及传递方法必须保持样品的完整性，不能对检测结果产生不利的影响。
用于测定1,2—二苯乙烯类药物的样品，必须在低于—18℃温度下保存和传递。