摘要：栀子蓝耐酸性好性质稳定，色泽鲜艳，着色力良好，是一个较好的天然着色剂，制备方法通常是二步法和发酵法。制备好之后通常使用层析法精制纯化工艺纯化，本文还介绍相关的栀子蓝国家标准和检测方法，国家标准主要分为感官和理化指标。

关键词：栀子蓝色素、精制纯化、层析法

栀子蓝色素是近年我国批准使用的天然食用着色剂，色调柔和，染色性能好，易溶于水，对酸碱、热、pH和多种常用抗氧化剂等较稳定。栀子蓝色素可采用微生物发酵法或酶促转化法制备。栀子果实或栀子黄生产废液中含有京尼平苷，经β-葡萄糖苷酶（转色酶）水解作用，从其糖苷键上脱去一分子葡萄糖转变为京尼平（geniposide），京尼平与伯氨化合物进行显色反应生成栀子蓝色素

β-葡萄糖苷酶，属纤维素酶类，能够水解结合于未端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放岀β-D-葡萄糖和相应配基，主要存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉及细菌体内。微生物发酵法是利用微生物产生β-葡萄糖苷酶转化底物京尼平苷，经发酵、提取获得栀子蓝色素。因该方法发酵液成分复杂，体系中存在的多种氨基酸均可与京尼平发生显色反应，转色酶发酵温度与酶促温度差别大等原因，故生产出的栀子蓝色素产品色泽暗，转化率低，异味大，难纯化。有报道采用一步酶促转化法制备栀子蓝色素，在反应体系中同时加入京尼平苷、β-葡萄糖苷酶、显色氦基酸，经酶转化制备，特异性髙，然而仍未解决酶解温度与显色温度差异较大的矛盾，使得生产周期较长，不利于规模化生产。

制备栀子蓝色素过程中，京尼平苷的纯度，酶系组成及对底物的亲和力，显色氨基酸种类等因素条件，影响栀子蓝色素的色泽、纯度、品质。

1栀子蓝的理化性质

对于二步法生产的栀子蓝色素来说，该色素易溶于水，70%以下的乙醇，不溶于无水乙醇，也不溶于油脂。水溶液呈现鲜明的蓝色最大吸收波长为592nm。色素在pH 2-8范围内色调无变化，100℃ 120分钟色素基本不褪色，对光和其它天然色素相比较稳定。对蛋白质及碳水化合物着色良好。N4+、K+、Mg2+、Al3+对色素无影响，Ca2+、Fe2+高浓度时略有影响，Fe3+、Sn4+对色素影响较大，抗坏血酸、双氧水、半胱氨酸对色素无影响，但亚硫酸钠，可使色素褪色。栀子蓝色素耐光、耐热、耐酸碱，尤其在酸性环境下有更好的稳定性，在偏碱条件下有増色效应。K+,NH4+,Na+,Mg2+，Ca2+对色素稳定性有一定影晌，但影响较小；Al3+,Cu2+，Ba2+对色素稳定性影响较大；Fe3+，Fe2+对色素稳定性影响最显著；氯化钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠对栀子蓝色素的颜色影响较小。文献结果表明，二步法生产的栀子蓝色素，耐酸性好性质稳定，色泽鲜艳，着色力良好，是一个较好的天然着色剂。以上特性可以为工业生产实际及使用时提供理论指导。

2栀子蓝的制备

2.1 栀子蓝色素的合成方法

目前，生产栀子蓝色素的方法主要有两种：一种是两步法，一是发酵法。

两步法是先将栀子苷水解成苷元，再与氨基酸反应生栀子蓝色素优化出栀子蓝色素分步制备的工艺条件，筛选出甲硫氨酸并优化了栀子蓝色素的的转化条件，当n甲硫氨酸：n栀子苷=6：1时、在pH 7.0、温度80℃条件下反应10h，可获得色价为20.6的栀子蓝色素。继续优化固定化酶法合成栀子蓝色素的条件，可在温度为50℃，pH为5的条件下，酶解6h，再将酶解产物与谷氨酸钠反应得到色价为120的栀子蓝色素。

发酵法是指将原料栀子苷与氨基酸及发酵菌种混在一起发酵培养，发酵菌种中产生的β-葡萄糖苷酶水解栀子苷，水解产物京尼平与培养基中的氨基酸反应转化成栀子蓝色素。有研究者研究了丝状真菌摇瓶发酵法转化为栀子蓝色素的方法并优化其工艺条件：栀子苷4%（纯度75%），摇瓶装量50/250mL，接种真菌量为4%，谷氨酸钠添加量2%，起始pH值为7.5的条件下培养120h，得到栀子蓝色素的色价大于90。研究表明栀子苷经米曲霉素发酵后与味精是制备栀子蓝色素的最优条件，10.64g栀子苷与129.36g水混合，加入米曲霉发酵液9.8mL，在50℃，160-180r/min的条件下水解6h，再投入3.15g味精，在80℃条件下反应4h，得到的栀子蓝色素色价为90.56.发酵法得到的栀子蓝色素色价通常不高。

2.2发酵法

2.2.1材料

2.2.1.1菌种及主要试剂

宇佐美曲霉 Asergillus usamiAs3.758（中科院微生物所）；栀子甙标准品（中国药品生物制品检定所，编号749-200108）；栀子（江西天顺生态农业有限公司）；β-葡萄糖苷酶（ Worthington Biochemical Corporation，3.4U/mg）；D301为沧州宝恩化工厂产品;其它试剂均为分析纯，所用水均为去离子水。

2.2.1.2培养基及标准溶液

种子培养基:马铃薯250g，葡萄糖20g，水1000mL，121°C灭菌20min备用；发酵培养基：4%栀子黄废液、0.4%K2HPO4、0.3%NaNO3、pH 6.5；0.132mg/mL京尼平甙标准溶液（E238mm为9.0）；0.2 mg/mL β-葡萄糖苷酶溶液。

2.2.1.3仪器与设备

U751GD型紫外可见分光光度计；GL-20G-工恒温振荡培养箱（广东医疗器械厂）；高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；PHS-25B数字酸度计（上海大普仪器公

2.2.2实验方法

2.2.2.1菌种制备

从活化斜面上挑起菌种到种子培养基中，25σmL三角瓶装液3mL，29℃、200rmin，振荡培养24h，然后过滤收集菌丝，并用少量蒸馏水洗涤菌丝，除去菌种表面少量培养基，再用等体积的0.85%NaC溶液悬浮菌体，备用

2.2.2.2栀子黄废液发酵转化生成栀子蓝色素

将步骤1.2.1所得菌丝悬液以一定接种量接入发酵培养基中，按250mL三角瓶装液30mL，29C、pH6.5、200r/min，振荡培养36h，发酵结束后置于50℃水解4h，过滤除去菌丝，滤液中加入0.7%谷氨酸钠，80℃反应h，即得栀子蓝色素。

2.3 栀子蓝色素的测定方法

取栀子蓝色素发酵液，稀释适当倍数，用1cm比色皿以蒸馏水为空白，在分光光度计上取波长590nm，测其吸光度值，栀子蓝色素含量与吸光度值成正比。用薄层层析法检测栀子蓝色素的纯度。

2.4 栀子蓝色素转化标准曲线的制定及转化率的定义

取OD238为一定值的栀子甙标准液2.0 mL，混匀后再加入1.0 mLβ-葡萄糖苷酶溶液，50°C水浴水解4h，然后再加入1.0mL 1% 谷氨酸钠溶液，80°℃水浴中反应1h，然后在590nm波长下测定吸光值，以OD238为X轴，OD590为Y轴作图，即为栀子蓝色素转化标准曲线转化率的定乂：假定栀子蓝色素转化标准曲线中D590值[下称OD590（标）]与0D238值[下称OD238（标）]之比为100%的转化率，栀子黄废液初始OD238值称OD238（试），栀子黄废液发酵转化后，测溶液OD590值称OD590（试），栀子蓝色素转化率定义如下：

转化率=[OD590nm（试）/OD238nm（试）OD590nm（标）OD238nm（标）]×100%

=[OD590nm（试）OOD590nm（标）]×100%

2.3 二步法

2.3.1材料

黑曲霉

种子培养基PDA斜面培养基。发酵培养基：麸皮100g；（NH4）2SO4 2g；KH2PO4 0.2 g；MgSO4·7H20,0.4g；蒸馏水100mL；自然pH。

栀子黄废液（其所含固形物中栀子苷含量约50%）安徽省亳州市亚强天然产物制品厂。

2.3.2方法

2.3.2.1 β-葡萄糖苷酶的发酵

用接种铲取岀—块适当大小的成熟种子培养基接入发酵培养基中，振荡混匀后置32℃恒温培养箱培养72h，发酵好的培养基加入10倍重量的蒸馏水浸提2h后抽滤，所得滤液即为浸提酶液。

2.3.2.2 栀子蓝的显色

将浸提酶液与栀子黄废液混和后水浴保温反应生成栀子苷元，栀子苷元液再与组氨酸髙温水浴可得栀子蓝溶液

2.3.2.3色素含量的测定

取栀子蓝溶液适当稀释后，用lcm比色皿，于590nm波长处测其OD值

2.3.2.4葡萄糖标准曲线的制作

分别取0.1%葡萄糖标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m，加蒸馏水至终体积1m，再加1mDNS试剂，混合后煮沸5min，冷却，用蒸馏水稀释至10m，于540nm波长处测定其OD值，以1m蒸馏水与1m DNS试剂的混和液为对照。所得结果作葡萄糖标准曲线

3 栀子蓝色素的精制纯化

3.1动态层析工艺条件选择

为了得到纯度和色价都较高的栀子蓝色素，有必要选择最佳的层析条件。选择直径为3cm的层析柱，考察不同的上样量洗脱速度和径长比对层析效果的影响。

3.1.1上样量的选择

由于上样量直接影响层析柱的柱效及分离效果，因此，首先考察上样量的影响，洗脱速度为0.10mL/s，径长比为1:20，实验结果见表1。

上样量/填料（g/g）	1:20	1:40	1:60
OD值	0.88	0.24	0.47

表1上样量对分离效果的影响上样量/填料（g/g）

通过表1可以看出，在层析柱径长比和洗脱时间不变的情况下，随着进样量的增加，分离效果明显变差。由柱层析的动力学分析可知，随着物料浓度的升高，传质动力增加，从而使物料在柱中的相对保留时间缩短；而进样量太少，单位时间内得到的产品很少，影响分离效率，因此选择上样量为1:40（上样量/填料）。

3.1.2洗脱速度的选择

当上样量/填料为1:40，径长比为1:20，研究不同洗脱速度对分离效果的影响，结果见表2。洗脱速度过快，洗脱剂消耗量太大，色带易拖尾，各种成分分离不彻底；洗脱速度慢，分离时间长，经济效益比较低，因此要选择合适的洗速度，由表2可知，选择洗脱速度为0.1m/s较为适宜。

洗脱速度（mL/s）	0.05	0.10	0.20	0.30
OD值	0.26	0.24	0.53	0.98

表2洗脱速度对分离效果的影响洗脱速度（mL/s）

3.1.3层析柱径长比的选择

对于选定的上样量填料和洗脱速度，层析柱的径长比是决定理论塔板数的一个重要因素，只有当理论塔板数达到一定值衬，也就是层析柱长度达到一定值时，混合物才能得到有效分离。当上样量/填料为1:40，洗脱速度为0.10mL/s，层析柱径长比对分离效果的影响见表3

直径/柱长（cm/cm）	1：10	1：20	1：30
OD值	0.75	0.24	0.29

表3径长比对分离效果的影响

由表3可见，当柱长减小时，分离效果明显变差。按层析塔板理论，柱高增加时，则理论塔板数増加，使物质分子的相对保留时间差异增大，物质组分的分离度提高。但也并不是层析柱越高越好，过的柱高可能产生以下几个问题：层析柱阻力增加，需要较高的操作压力；保留时间延长，单位时间内能获得的产品量减少；由于扩散作用的影响较大，引起层析峰形的扩散、产物浓度的降低等。

根据实验的结果，选择层析柱的径长比为1:20。

3.2层析柱的使用周期

在室温下，径长比1:20，上样量/填料比为1:40，洗脱速度为0.10mL/s的条件下对同一根柱子进行重复实验，测得其可重复使用6次以上

3.3精制纯化效果验证

准确称取原料0.1191g，用蒸馏水溶解后定容于100mL的容量瓶中，用紫外-可见分光光度计进行扫描，得其色价为27，OD值为1.03

准确称取层析法精制纯化后的栀子蓝色素产品0.1084g，用蒸馏水溶解后定容于100mL的容量瓶中，用紫外-可见分光光度计进行扫描，得其色价为238， OD值为0.24

精制纯化的效果表明，用壳聚糖衍生物为填料对栀子蓝素色进行层析法精制，其色价提高了8.8倍，其OD值下降了39%。

4 栀子蓝色素的标准

4.1范围

本标准适用于以栀子的果实为原料，经水或食用乙醇浸提、酶解（β葡萄糖苷酶）、添加食用氨基酸化合、精制等工艺加工制成的食品添加剂栀子蓝。

4.2 技术要求

4.2.1感官要求

项目	要求	检测方法
气味	略有特殊的芳香性气味	取适量样品置于清洁、干燥的白瓷盘中，在自然光线下，观察其色泽和状态，并嗅其气味
色泽	蓝色至深紫蓝色
状态	粉末、粒状或液体

4.2.2 理化指标

项目	指标
项目	粉末、粒状	液体
色价E1cm1%（580-620）nm	符合声称
干燥减量，w/% ≤	7	——
铅（Pb）/(mg/kg) ≤	3	3
总砷（以As计）/(mg/kg) ≤	2	2

注：商品化的栀子蓝产品应以符合本标准的栀子蓝为原料，可添加食用糊精和(或)乳糖而制成，其色价符合声称。

5栀子蓝的检测

5.1 一般规定

本标准所用试剂和水，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和GB/T 6682中规定的三级水。分析中所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T 601、GB/T 602、GB/T 603的规定制备。本试验所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。

5.2 鉴别试验

5.2.1 试剂和材料

0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液：准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）71.64 g，用水定容至1000 mL。0.1 mol/L 柠檬酸溶液：准确称取柠檬酸（C6H8O7·H2O）21.01g，用水定容至1000 mL。pH7.0柠檬酸缓冲液：0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液16.47 mL与0.1 mol/L柠檬酸溶液3.53 mL混合。次氯酸钠溶液：有效氯含量在4%以上。

5.2.2 分析步骤

5.2.2.1最大吸收波长

取5.3.2色价测定中的栀子蓝试样液，用分光光度计检测，在波长580 nm-620 nm之间应有最大吸收峰。

5.2.2.2颜色反应

用pH 7.0柠檬酸缓冲液配制0.1%试样液，应呈蓝色。

5.2.2.3褪色反应取0.1%试样液5mL，加盐酸1~2滴，再加含有效氯4%以上的次氯酸钠溶液1~3滴，应褪色。

5.3 色价的测定

5.3.1 仪器和设备

分光光度计。

5.3.2 分析步骤

称取约0.2 g试样，精确至0.0001 g，用水溶解，转移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，然后吸取10 mL，转移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀。取此试样液置于1 cm比色皿中，以水做空白对照，用分光光度计在580 nm-620 nm内的最大吸收波长处测定吸光度。（吸光度应控制在0.3-0.7之间，否则应调整试样液浓度，再重新测定吸光度。）

5.3.3 结果计算

色价以被测试样液浓度为1 %、用1 cm 比色皿、在580 nm~620 nm范围内最大吸收波长处测得的吸光度E1cm1%（580-620）nm计，按公式（5.1）计算：

E1cm1%（580-620）nm=A/C × 1/100...........................................（5.1）

式中：

A——实测试样液的吸光度

C——被测试样液浓度的数值，单位为克每毫升（g/mL）

100—浓度换算系数

实验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过2%。

6 展望

天然色素主要以红、黄色调为主，蓝色素非常稀少，文献中常以贵重”、“极少”、“罕见”等词语提及。在我国GB2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》中列出的56种色素中蓝色素仅有栀子蓝色素和藻青素（即藻蓝蛋白色素）两种。蓝色是三原色之一，可用于多种色调的调配，但由于蓝色素非常稀少，使得天然蓝色素在国内外市场上均供不应求，因此积极开展天然蓝色素的研究开发工作，必将具有极大的现实意乂和诱人的市场前景。

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