主题：【第十七届原创】磷脂分离分析方法

磷脂分离分析方法

2003年，Han等正式提出了脂质组学的概念，即对生物样品中脂质进行全面的系统分析，并以此为依据推测其他与脂质作用的生物分子的变化，进而阐明脂质在各种生命现象中的作用机制。脂质尤其是磷脂，是细胞膜的关键组分，磷脂代谢的改变对细胞膜结构有深远的影响，尤其是癌细胞需要更多的膜来实现快速增殖。因此，膜磷脂的含量、磷脂代谢物水平和磷脂谱的变化^[99]通常被确定为癌症发展进程的标志，此外，磷脂代谢的改变也与糖尿病、人体衰老与肥胖有关。基于磷脂重要的生理与病理功能，需要快速、准确的分离分析手段实现对其的定性与定量分析，进而阐明其组分变化对机体的影响，为临床诊断和治疗提供重要依据。

磷脂分子是由亲水性头基和亲脂性/疏水性尾基组成，根据亲水性头基的取代基团的不同又可分为PC、PE、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰甘油（PG）等。目前，磷脂分离分析面临的主要挑战包括两方面，一方面是磷脂本身复杂和多样的结构信息，包括类别、脂肪酰基种类、脂肪酰基sn-位置和脂肪酰基中的C=C位置/几何形状（即顺式/反式）等，导致其识别与鉴定的难度很大。另一方面是分离分析工具与技术的限制。最初用于脂质组学的分析方法是基于质谱的鸟枪法，即直接将样品注入到质谱仪中，尽管该方法具有简便高效的优点，但是会导致样品中的杂质包括盐、极性代谢物和蛋白质等对脂质的电离造成影响，影响信号的稳定，最终会影响质谱的检测结果。此外，这些杂质也会污染质谱仪。近年来，高灵敏度和特异性的高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）法成功弥补了鸟枪法的缺陷。由于在质谱分析之前增加了色谱分离过程，一方面可以有效减少样品中杂质的影响，另一方面基于其分离能力，可以将磷脂按照类别与种类进行初步的分离，减少了后续质谱分析的基质效应和离子抑制效应，大大改善了磷脂的分离分析效果。

色谱固定相作为HPLC的核心组成，发挥着至关重要作用。开发新型色谱固定相是脂质组学的重要研究方向之一。例如，Liang等以半胱氨酸为衍生化试剂，合成了苯乙烯马来酸共聚物色谱固定相Sil-SMA-amino acid，填充Sil-SMA-amino acid色谱柱对于亲疏水性的小分子具有良好的分离性能，同时该色谱柱具有RPLC/HILIC/IEC的混合模式保留机制，成功实现了部分PC和PE标准品的种类分离，并成功应用于胃癌细胞脂质提取物的分离分析，表现出了一定的应用潜力。Liu等以三辛基膦和烯丙基溴为原料合成了膦基离子液体三辛基（烯丙基）溴化膦（[P_888Allyl]Br）。以[P_888Allyl]Br为聚合单体，通过点击化学反应合成了聚膦离子液体功能化二氧化硅球（PIL@SiO₂）。PIL@SiO₂填充色谱柱表现出RPLC/HILIC混合模式分离特点，可在较短的时间内实现核酸碱基与核苷类、磺胺类、酰胺类和苯胺类物质的快速分离，具有良好的分离选择性。其对于磷脂标准品的分离效果优于商业化的氨基柱，并可用于磷脂类别与种类的同时分离分析。此外，也实现了大豆卵磷脂的快速分离分析。